旋覆花素體外抗腫瘤作用研究

魏海青 李 軍霞 王永利

腫瘤是一類常見病、多發(fā)病，已成為危害人類健康最嚴重的疾病之一?；瘜W治療是治療癌癥的主要手段，但化療藥物在對腫瘤細胞發(fā)揮細胞毒作用的同時，會引起一系列的不良反應，如骨髓抑制、消化道反應等。因而，近年從天然藥物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物成為研究熱點［1，2］，菊科旋覆花屬植物歐亞旋覆花素是一種傳統(tǒng)中草藥，具有抗炎，抗肝炎、抗肝損傷等作用［3，4］，本實驗研究旋覆花素對小鼠肝癌 H22細胞株、小鼠肉瘤S180細胞株、人肺腺癌A549細胞株、人卵巢癌SK-OV3細胞株及人宮頸癌Hela細胞株的生長抑制作用，并將同一濃度對以上5種腫瘤細胞的生長抑制作用進行對比，了解其對以上5種腫瘤細胞的生長抑制作用特點。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株:小鼠肝癌H22細胞、小鼠肉瘤S180、人肺腺癌A549細胞、人卵巢癌SK-OV3細胞、人宮頸癌細胞株Hela細胞。河北醫(yī)科大學藥理教研室傳代保存。

1.2 藥品與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和小牛血清購自美國GIBCO公司;青霉素、鏈霉素購自華北制藥廠;順鉑注射液(DDP)購自南京制藥廠;二甲基亞砜(DMSO)、MTT、丫啶橙、溴化乙錠購自美國Sigma公司。旋覆花素由河北醫(yī)科大學藥理教研室藥學院自制。

1.3 主要儀器 VD-1320型潔凈工作臺產(chǎn)自哈爾濱市東聯(lián)電子技術發(fā)展有限公司;CO2培養(yǎng)箱產(chǎn)自日本 Sanyo公司;Floustar多功能分析儀產(chǎn)自德國BMG公司;平板離心機產(chǎn)自德國eppendorf公司;XDS-1B型倒置生物顯微鏡產(chǎn)自重慶光電儀器有限公司;激光共聚焦顯微鏡產(chǎn)自德國Leica等。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組:取對數(shù)生長期的 H22、S180、A549、SK-OV3、Hela細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml的細胞懸液。將細胞懸液種植于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，按分組方法加入相應的藥物，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，棄去各孔上清，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min使其溶解后，測定樣品吸光度值，并計算半數(shù)抑制濃度IC50。實驗分為陰性對照組、藥物組、陽性對照組(順鉑)。

1.4.2 倒置顯微鏡下觀察旋覆花素對以上5種腫瘤細胞形態(tài)的影響:取對數(shù)生長期的細胞，培養(yǎng)方法和實驗分組同上，給藥72 h后觀察各組細胞形態(tài)學變化。

1.4.3 在激光共聚焦顯微鏡下觀察旋覆花素對以上5種腫瘤細胞形態(tài)的影響:取對數(shù)生長期的細胞，培養(yǎng)方法和實驗分組同上，給藥72 h后取出細胞懸液滴于載玻片上，滴加丫啶橙/溴化乙錠染色，置共聚焦顯微鏡下觀察?；罴毎巳旧|(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu);早期凋亡細胞核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀;死亡細胞核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu);晚期凋亡細胞核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用 Origin 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，量效曲線擬合選用Hill法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對細胞的抑制的作用 對小鼠肝癌H22細胞株、小鼠肉瘤S180細胞株、人肺腺癌A549細胞株、人卵巢癌SK-OV3細胞株及人宮頸癌Hela細胞株的生長抑制作用以及對比順鉑(1 000 μg/ml)對 H22細胞、S180細胞、A549細胞、SK-OV3和Hela細胞的抑制率為(91.9 ±2.9)%、(84.6 ±5.0)%、(79.8±4.5)%、(80.4 ±3.8)%和(8.0 ±2.2)%。旋覆花素對腫瘤細胞的生長抑制作用有一定的選擇性，旋覆花素對H22、S180、A549及SK-OV3 4種腫瘤細胞的生長抑制作用均較明顯，而對Hela細胞的抑制作用均較低，在1 000 μg/ml劑量時，旋覆花素對H22細胞株、S180細胞株、A549細胞株、K-OV3細胞株及Hela細胞株的抑制率分別為 92.39%，88.90%，89.51%，67.50%，12.36%。與順鉑陽性對照組相比，除Hela細胞外，對其他4種細胞的抑制作用與陽性對照組的抑制率相差不多，顯示出明顯的抑制作用，而且對這四種細胞的生長抑制作用隨劑量的增加而增高。見表1、2，圖1。

表1 旋覆花素對H22、S180、A549細胞的抑制作用n=9，%，±s

表1 旋覆花素對H22、S180、A549細胞的抑制作用n=9，%，±s

注:H22細胞的IC50為(76±4)μg/ml;S180細胞 IC50為(244±24)μg/ml;A549細胞IC50為(102±9)μg/ml

濃度(μg/ml) H22抑制率 S180抑制率 A549抑制率31.25 11.5 ±6.0 5.1 ±2.0 13.5 ±1.5 62.5 34.4 ±5.5 8.4 ±3.7 25.9 ±4.9 125 70.1 ±3.3 12.0 ±4.9 56.8 ±3.4 250 80.3 ±5.5 46.4 ±4.1 72.3 ±3.3 500 86.0 ±4.0 84.7 ±2.2 88.0 ±5.3 1 000 92.4 ±3.9 88.9 ±4.8 89.5 ±3.9

表2 旋覆花素對SK-OV3、Hela細胞的抑制作用 n=9，%，±s

表2 旋覆花素對SK-OV3、Hela細胞的抑制作用 n=9，%，±s

注:SK-OV3細胞 的IC50為(171±11)μg/ml;Hela細胞 IC50不確定

濃度(μg/ml) SK-OV3抑制率 Hela抑制率31.25 3.8 ±2.8 1.5 ±1.3 62.5 6.7 ±4.8 3.9 ±1.5 125 18.2 ±4.6 14.1 ±0.7 250 52.3 ±4.0 17.6 ±1.6 500 65.6 ±4.4 13.9 ±0.8 1 000 67.5 ±5.9 12.4 ±1.1

圖1 不同濃度旋覆花素對H22、S180、A-549、SK-OV3和Hela細胞的抑制作用

2.2 細胞形態(tài)

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡下細胞形態(tài)變化

2.2.1 倒置顯微鏡下觀察:陰性對照組H22細胞形態(tài)較圓，細胞膜比較完整光滑，旋覆花素組的細胞形態(tài)較為不規(guī)則，膜表面不平整，出現(xiàn)皺縮，胞漿內(nèi)容物外泄，隨著含藥濃度的增加，圓形細胞密度數(shù)目不斷減少，不規(guī)則及碎裂的細胞數(shù)目不斷增加，細胞生長總體密度明顯下降;陰性對照組的S180細胞狀態(tài)良好，旋覆花素組的細胞均可見形態(tài)的變化，出現(xiàn)部分細胞脫落，漂浮于培養(yǎng)液中，也有部分細胞體積增大、腫脹、破裂，呈壞死狀;陰性對照組的A549細胞形態(tài)良好呈梭形，細胞膜完整，旋覆花素組可見隨著濃度的增加，細胞皺縮，形狀不規(guī)則，數(shù)目減少，有些細胞變小、變圓，有些細胞變大、到高濃度時可見較多的死亡細胞，特別是1 000 μg/ml濃度時，作用 A549細胞72 h后，可見更多的死亡細胞;陰性對照組的SK-OV3細胞形態(tài)良好，旋覆花素組可見隨時間推移出現(xiàn)細胞皺縮，細胞數(shù)目隨濃度增加明顯較少，培養(yǎng)液中可見壞死狀細胞明顯增多;陰性對照組的Hela細胞生長良好，細胞伸展，呈不規(guī)則多角形。旋覆花素組細胞數(shù)目無明顯減少，隨著時間的推移，細胞皺縮不明顯，培養(yǎng)液中有少許漂浮的呈桑葉狀細胞，隨濃度增高時上述改變也不明顯。

2.2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察:陰性對照組H22細胞結(jié)構(gòu)清晰，胞漿較豐富，呈均勻的橘黃色或橘紅色熒光，胞核呈黃色或黃綠色均勻熒光，旋覆花素組的細胞核致密濃染或呈黃綠色碎片狀，也可見到熒光染色減弱或消失的壞死細胞形態(tài);陰性對照組S180細胞熒光染色均勻，未見熒光染色減弱或消失的壞死細胞形態(tài)，旋覆花素組可見細胞核固縮、碎裂、染色質(zhì)邊集并出現(xiàn)凋亡細胞;陰性對照組A549細胞熒光染色較淺且較均勻，未見凋亡細胞。給藥組可以看到細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，凋亡細胞的細胞核固縮，染色質(zhì)凝集或核片段形成凋亡小體;陰性對照組SK-OV3細胞著色均勻，細胞結(jié)構(gòu)清晰，旋覆花素組可見細胞核濃染或片狀，可見染色減弱的壞死細胞形態(tài);陰性對照組Hela細胞結(jié)構(gòu)無明顯變化。

3 討論

細胞活力大多通過檢測兩個特征參數(shù)來反映，即細胞代謝活力和細胞膜的完整性。代謝旺盛的細胞可以將四唑藍如MTT等代謝為紫色/深棕色產(chǎn)物，用代謝產(chǎn)物的光密度值可以定量反映細胞的代謝活力［5］。本試驗通過MTT法檢測細胞的存活和生長，并計算藥物的IC50值，通過IC50值的大小來制定藥物作用的強弱和特異性，結(jié)果表明，旋覆花素在體外具有一定的抗腫瘤作用且有一定的選擇性，對人宮頸癌Hela細胞株的生長抑制作用較差，對小鼠肝癌H22細胞株、小鼠肉瘤S180細胞株、人肺腺癌A549細胞株、人卵巢癌SK-OV3細胞株作用強，而且，旋覆花素對這四種細胞的生長抑制作用隨劑量的增加而增高，有劑量依賴關系。凋亡和壞死是藥物引起腫瘤細胞死亡的兩種主要方式［6，7］，旋覆花素對細胞的生長抑制作用是否也是通過誘導凋亡和引起細胞死亡實現(xiàn)的。本試驗中，我們在倒置顯微鏡下及激光共聚焦顯微鏡下看到旋覆花素可引起腫瘤細胞死亡，和旋覆花素對腫瘤細胞的抑制率結(jié)果一致，鏡下結(jié)果顯示，H22細胞、S180細胞、A549細胞和SK-OV3細胞經(jīng)旋覆花素作用后出現(xiàn)明顯的細胞死亡，但Hela細胞死亡較少。進一步從激光共聚焦的結(jié)果可以看到，旋覆花素對腫瘤細胞的生長抑制作用與其誘導凋亡和引起壞死有關。這些結(jié)果為旋覆花素用于抗腫瘤作用提供依據(jù)，但其應用需要整體動物實驗的支持。

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4 郭啟雷，楊俊山.旋覆花屬植物中倍半萜類成分及藥理活性藥理活性研究進展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17:804.

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7 Ellis PA，Smith IE，Mccarthy K，et al.Preoperative chemotherapy induces apoptosis in early breast cancer.The Lancet，1997，23:347-349.