桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化增強(qiáng)Mel18表達(dá)

劉黎瓊 劉 澤林 王 欣 王 淡瑜 崔 海燕 金夢(mèng)迪

惡性腫瘤的誘導(dǎo)分化治療已成為目前腫瘤生物學(xué)和腫瘤治療學(xué)的前沿領(lǐng)域和研究熱點(diǎn)，尤其是中藥提取物的誘導(dǎo)分化研究是熱點(diǎn)中的熱點(diǎn)。桂皮醛是食用香料肉桂提取物的主要活性成分，具有安全無毒特點(diǎn)。桂皮醛可對(duì)多種惡性腫瘤調(diào)亡發(fā)揮抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)，我們的前期研究也顯示桂皮醛可誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株K562凋亡，但尚無桂皮醛誘導(dǎo)分化效應(yīng)研究的報(bào)道［1－3］。本實(shí)驗(yàn)觀察桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化改變及探討相關(guān)機(jī)制，以進(jìn)一步研究桂皮醛抗腫瘤的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與主要試劑 人慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院干細(xì)胞研究與應(yīng)用中心保存。桂皮醛(分子式C9H8O，分子量132.16，純度大于95%，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，用二甲基亞砜配成貯存液。藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗人CD11b單克隆抗體(CD11b-PE)、異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人CD14抗體(CD14-FITC)購自美國 BD(Becton，Dickinson and Company)公司。兔抗人Mel18多克隆抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體(IgG-FITC)購自Santa Cruz公司。兔抗人c-Myc多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Cell signaling公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 K562細(xì)胞用RMPI 1640完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)(要求細(xì)胞活性＞98%)。實(shí)驗(yàn)組加入桂皮醛使終濃度分別為30 μmol/L和60 μmol/L，對(duì)照組加入等體積含二甲基亞砜的RPMI 1640(二甲基亞砜濃度與實(shí)驗(yàn)組相同，均 ＜0.1%)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

1.3.1 細(xì)胞分化檢測(cè):收集各組細(xì)胞，充分洗滌后，加入CD11b-PE和CD14-FITC標(biāo)記，PBS洗后重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)經(jīng)CellQuest軟件進(jìn)行分析。

1.3.2 Mel18表達(dá)檢測(cè):收集各組細(xì)胞，固定，破膜，加入兔抗人Mel18單抗(一抗)，孵育，洗滌后加入羊抗兔 IgG-FITC標(biāo)記(二抗)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)經(jīng)CellQuest軟件進(jìn)行分析。

1.4 Western blot檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，凝膠分離、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交。一抗為兔抗人c-Myc抗體或兔抗GAPDH抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG。充分漂洗后在化學(xué)放光試劑中反應(yīng)，暗房曝光后沖洗膠片、掃描，輸入計(jì)算機(jī)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桂皮醛對(duì)K562細(xì)胞表面分化抗原的影響 經(jīng)30 μmol/L和60 μmol/L桂皮醛處理24 h后，K562細(xì)胞表面單核細(xì)胞分化抗原CD11b和CD14表達(dá)率增加，并呈濃度依賴性改變，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。這提示桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核細(xì)胞方向分化。

表1 桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化抗原表達(dá)n=3，%，±s

表1 桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化抗原表達(dá)n=3，%，±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01

組別 CD11b陽性率 CD14 2.9 ±0.6 2.3 ±1.3實(shí)驗(yàn)組30 μmol/L 10.9 ±1.3* 8.7 ±1.3*實(shí)驗(yàn)組60 μmol/L 75.7 ±2.3* 84.1 ±3.5陽性率對(duì)照組*

2.2 桂皮醛增強(qiáng)Mel18表達(dá) K562細(xì)胞自身表達(dá) Mel18，60 μmol/L桂皮醛處理24 h后，k562細(xì)胞Mel18平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比明顯增加;見圖1。這提示桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化伴Mel18表達(dá)增加。

2.3 桂皮醛降低c-Myc表達(dá) 經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，c-Myc在K562細(xì)胞陽性表達(dá)，經(jīng)60μmol/L桂皮醛處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞分化后，c-Myc表達(dá)明顯下降。見圖2。

圖1 桂皮醛增強(qiáng)K562細(xì)胞Mel18表達(dá)

圖2 桂皮醛降低c-Myc表達(dá)

3 討論

白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，白血病細(xì)胞增殖失控、凋亡和分化受阻，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和分化是目前白血病化學(xué)治療的主要方法。有報(bào)道證實(shí)，許多通過細(xì)胞毒方式殺傷白血病的藥物在低濃度時(shí)可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化;多種傳統(tǒng)中藥的活性成分對(duì)白血病細(xì)胞同時(shí)有誘導(dǎo)凋亡和分化效應(yīng)［4］。桂皮醛是食用香料肉桂提取物的主要活性成分，在癌癥防治方面具有重要作用，我們的前期工作發(fā)現(xiàn)較高濃度桂皮醛可誘導(dǎo)K562凋亡［3］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)低濃度桂皮醛可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞K562分化，并表現(xiàn)為濃度依賴性。

癌基因激活和抑癌基因失活是各種腫瘤發(fā)生和演進(jìn)的基礎(chǔ)，增強(qiáng)抑癌基因的表達(dá)和功能可抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡［5］。mel18為PcG基因家族成員，表達(dá)于正常乳腺組細(xì)胞和較成熟造血細(xì)胞［6，7］。研究發(fā)現(xiàn)，分化抑制因子1(inhibitor of differentiation Id1)可通過下調(diào)mel18表達(dá)進(jìn)而上調(diào)原癌基因c-myc，有助于腫瘤發(fā)生［8］。增強(qiáng)mel18表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞株克隆形成和原癌基因c-Myc表達(dá)，我們既往研究顯示轉(zhuǎn)染外源性 mel18可抑制人白血病細(xì)胞U937生長［9，10］。以上結(jié)果顯示，mel18為一潛在抑癌基因。近來研究發(fā)現(xiàn)mel18在原代急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞也有廣泛表達(dá)［11］。因此，mel18在白血病中具體發(fā)揮何種作用尚不明確，值得進(jìn)一步深入探討。本研究發(fā)現(xiàn)，人白血病細(xì)胞K562表達(dá)Mel18及c-Myc，桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化同時(shí)增強(qiáng)Mel18表達(dá)和削弱c-Myc表達(dá)。這說明mel18雖然在白血病細(xì)胞中也有表達(dá)，但mel18表達(dá)增強(qiáng)仍有助于白血病細(xì)胞向成熟方向分化，發(fā)揮抑癌基因功能，Mel18表達(dá)增加可能是桂皮醛誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的重要機(jī)制之一，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，桂皮醛可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，PcG基因家族成員mel18參與這一過程，發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。這為桂皮醛對(duì)白血病的作用及其機(jī)制研究提供了新的理論參考依據(jù)，并為mel18在白血病中作用的研究提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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