黃芪注射液對阿霉素中毒性心肌損傷小鼠心肌細胞線粒體膜電位及GSH的影響*

梁麗英 陳 晶 賀 毅

阿霉素（adriamycin，ADM）用于治療各種惡性腫瘤。但是，由于其具有明顯的心臟毒性，臨床應用受到限制。阿霉素心臟毒性與心肌細胞凋亡有關(guān)，在細胞凋亡過程中，線粒體起著關(guān)鍵性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在細胞凋亡的早期階段，細胞發(fā)生病理改變前，線粒體膜電位就已經(jīng)下降，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)[1]。黃芪注射液對細胞線粒體膜電位下降有抑制作用[2]。本研究旨在探討其拮抗阿霉素心臟毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 阿霉素（注射用鹽酸多柔比星10 mg/瓶，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：090201B）；黃芪注射液（2 g/mL，正大青春寶有限公司，批號：0901073）。JC-1細胞線粒體膜電位試劑盒（5 mg/瓶，美國Biovision，批號：ENZ-52304）。還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（100T，批號：20100302，南京建成生物工程技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗動物 昆明小鼠60只（廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，SCXK桂-2003-0003），雄性，清潔級，體質(zhì)量18～20 g。

1.3 儀器設(shè)備 流式細胞分析系統(tǒng)（美國BECKAN COUL?TER公司，型號：Epics XL）；移液器（德國EPPENDORF公司）；756型紫外分光光度計（上海菁華儀器廠）。

1.4 實驗方法 采用隨機平行同期對照的方法，建立小鼠阿霉素中毒性心肌損傷（ADR）動物模型。60只小鼠按隨機數(shù)字表分為黃芪注射液治療組（大、中、小3個劑量組）、阿霉素模型組和正常對照組。正常對照組每日腹腔注射生理鹽水10 μL/g；阿霉素模型組，隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g；黃芪注射液治療組，隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g，另外大、中和小劑量組每日腹腔分別注射黃芪注射液12、6和3 μg/g。所有動物均自由飲食。連續(xù)給藥14 d。

1.5 檢測指標與方法 （1）心臟系數(shù)測定：稱取小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，處死后取出心臟，用電子分析天平準確稱量全心濕質(zhì)量，計算心臟系數(shù)（全心濕質(zhì)量/體質(zhì)量）。（2）心肌組織中GSH的檢測：取心肌約50 mg，置于預冷的PBS中，洗去殘留血液，用濾紙吸干水分，在4℃冰浴中制備10%的心肌組織勻漿，低溫離心3 000 r/min，30 min，取上清比色法檢測GSH。（3）心肌細胞線粒體膜電位檢測：取心臟約50 mg，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)的濃度為106個/mL。用流式細胞儀檢測，將100 μL細胞懸液（106個/mL）加入5 mL的流式測定管中，同時設(shè)立陰性對照管。在測定管中加入1 μL JC-1工作液，陰性對照管不加。輕輕混勻。將測定管和對照管置于37℃培養(yǎng)箱中孵育15～20 min；吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測定管和對照管中，上機檢測。流式細胞儀激發(fā)波為488 nm，紅色熒光的最大發(fā)射波長為580/590 nm，綠色熒光的最大發(fā)射波長為510/527 nm，以紅/綠熒光強度比值代表細胞線粒體膜電位，圖像采用Cell Quest軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以均數(shù)±標準差±s）表示，方差不齊時采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟系數(shù)結(jié)果 各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與正常對照組比較，黃芪注射液小劑量組心臟系數(shù)偏大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與黃芪注射液大劑量組、中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）,見表1。

2.2 心肌組織中GSH檢測結(jié)果 各組分別與阿霉素模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；黃芪注射液各劑量組相互比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 線粒體膜電位 阿霉素模型組與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；黃芪注射液各劑量組與正常對照組比較，差異也有統(tǒng)計學意義（均P<0.01），見表3。

表1 黃芪注射液對ADR小鼠心臟系數(shù)的影響 ±s）

表1 黃芪注射液對ADR小鼠心臟系數(shù)的影響 ±s）

**P<0.01

正常對照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 4.11±0.10 4.44±0.14 4.18±0.13 4.21±0.16 4.24±0.18 7.140**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001 0.193 0.104 0.036<0.001組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P<0.001 0.003 0.624 0.411 0.738統(tǒng)計學處理組別 n 心臟系數(shù)（mg/g）

表2 黃芪注射液對ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s）

表2 黃芪注射液對ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s）

**P<0.01

正常對照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 3.99±0.47 2.02±0.22 2.77±0.16 2.88±0.56 2.67±0.28 36.118**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P<0.001<0.001 0.609 0.550 0.270統(tǒng)計學處理組別 n GSH（mg/g）

表3 黃芪注射液對ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s）

表3 黃芪注射液對ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s）

**P<0.01

正常對照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 1.86±0.22 0.88±0.27 1.43±0.16 1.33±0.18 1.07±0.14 40.523**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001<0.001<0.001<0.001 0.027組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P 0.001<0.001 0.002<0.001 0.211統(tǒng)計學處理組別 n線粒體膜電位（FL2/FL1）

3 討論

心肌細胞凋亡可直接導致心臟動力來源減少,凋亡細胞局部纖維化可誘發(fā)心律失常。線粒體跨膜電位（mitochondrial membrane potential）紊亂是細胞凋亡時發(fā)生的細胞內(nèi)事件之一，是細胞凋亡過程中的重要事件，其可導致在線粒體膜上形成孔洞，細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中。線粒體內(nèi)容物釋放的調(diào)控被認為與線粒體膜上一種稱為permeability transition pore（PT pore）的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔有關(guān)，此孔道打開會造成線粒體內(nèi)膜兩側(cè)H+梯度消失、線粒體膜電位下降，造成線粒體漲大，外膜漲破之后細胞色素C釋放到細胞液中引起細胞凋亡[3]。線粒體膜電位下降是細胞凋亡的特征性標志，維持正常的線粒體膜電位是抑制細胞凋亡的重要手段[4]。本研究選用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1），它是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)（ma?trix）中，形成聚合物（J-aggregates），可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體（monomer），可以產(chǎn)生綠色熒光，這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。紅綠熒光的相對比例常用來衡量線粒體膜電位。本研究結(jié)果顯示，黃芪注射液能穩(wěn)定心肌細胞膜電位，抑制膜電位下降，減緩心肌細胞凋亡。

線粒體是能量產(chǎn)生的重要場所，在產(chǎn)生能量的同時也會產(chǎn)生大量的氧自由基（ROS），ROS過多會造成線粒體損傷、膜電位下降、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放和細胞色素C等凋亡相關(guān)因子釋放[3]。GSH參與體內(nèi)氧化還原過程，能和過氧化物及自由基結(jié)合，以對抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞，同時還可對抗自由基對重要臟器的損害，是人體組織中用于清除ROS的抗氧化劑。GSH不僅參與細胞抗氧化反應、維持機體的氧化還原平衡，還參與了調(diào)節(jié)細胞增生、機體免疫應答。GSH降低是潛在的凋亡早期激活信號，隨后產(chǎn)生的ROS促使細胞發(fā)生凋亡，即細胞發(fā)生凋亡時，細胞漿內(nèi)的GSH水平會降低[5]，因此檢測GSH水平可以判斷和檢測細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示黃芪注射液可提高ADR小鼠細胞漿內(nèi)GSH，保護心肌細胞，抑制細胞凋亡。

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[3]Correa F,Soto V,Zazueta C.Mitochondrial permeability transition rel?evance for apoptotic triggering in the post-ischemic heart[J].Int J Biochem Cell Biol，2007,39(4):787-798.

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