干擾海馬spastin表達(dá)通過抑制突觸傳遞介導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能障礙*

李志坤，祝 瑋，王晗婕，鄭雪峰，郭國慶，張吉鳳

（暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院解剖學(xué)系，認(rèn)知與發(fā)育障礙神經(jīng)科學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632）

SPAST是遺傳性痙攣性截癱（hereditary spastic paraplegia，HSP）的致病基因，約有40%的HSP系由SPAST基因突變所致［1-2］。單純型HSP患者神經(jīng)系統(tǒng)的主要病理改變?yōu)槠べ|(zhì)脊髓束的退行性變，表現(xiàn)為雙下肢的痙攣性癱瘓［3］；而復(fù)雜型HSP常伴有認(rèn)知功能異常，包括學(xué)習(xí)記憶減退和注意力缺陷等不同程度的認(rèn)知障礙［4-5］。認(rèn)知功能障礙發(fā)生的原因是什么，是否與SPAST編碼的spastin蛋白的功能缺失有關(guān)？spastin是AAA型ATP酶活性的蛋白，主要功能是把微管切割成短的片段，以釋放微管的動(dòng)力［6］，除了AAA型ATP酶結(jié)構(gòu)域，spastin的N端還具有一個(gè)疏水的HR結(jié)構(gòu)域，以及MIT和MTBD結(jié)構(gòu)域，MTBD負(fù)責(zé)把spastin錨定于微管，而MIT結(jié)構(gòu)域則參與細(xì)胞內(nèi)膜管的形成和物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)［7］。我們前期研究顯示，spastin的MIT結(jié)構(gòu)域能夠與AMPA受體結(jié)合，參與谷氨酸能受體的轉(zhuǎn)運(yùn)［8］，從而改變培養(yǎng)神經(jīng)元的樹突棘可塑性，提示spastin介導(dǎo)的AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)功能可能與認(rèn)知功能障礙有關(guān)。為了驗(yàn)證我們的推測，本研究特意干擾小鼠海馬部位spastin蛋白的表達(dá)，用膜片鉗技術(shù)檢測突觸傳遞的功能，并評(píng)估小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，借以明確spastin是否參與小鼠認(rèn)知功能的調(diào)控。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，4周齡，15～17 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SYXK（遼）2020-0001。分籠飼養(yǎng)，自由飲水食，控制環(huán)境溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，晝夜交替時(shí)間為8：00與20：00。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并通過暨南大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

2 主要儀器與試劑

小鼠腦立體定位注射儀（瑞沃德）；微量注射泵（KDscientific）；冰凍切片機(jī)CM1860和振動(dòng)切片機(jī)1200s（Leica）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)行為分析系統(tǒng)（Clever Sys Inc）；雙極同心圓刺激電極（FHC）；拉制儀P97及Integrated Patch Amplifier（Shutter）；正 置 顯 微 鏡Eclipse FN1（Nikon）；數(shù)字切片掃描儀（Pannoramic）。spastinⅠ抗、GADPHⅠ抗及河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）購 自Sigma；辣 根 過 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的Ⅱ抗（ABclonal）；苦毒寧（picrotoxin，PTX）購自Tocris；高爾基染液試劑盒（ZCIBIO）；重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載 體rAAV-U6-shSpastin-CMVEGFP-pA和rAAV-U6-Scramble-CMV-EGFP-pA（樞密科技有限公司）。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組4周齡雄性C57BL/6小鼠60只，體重15～17 g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)（sh-Spastin）組和對(duì)照（control）組，每組30只。

3.2 海馬定向注射參照Keiser等［9］實(shí)驗(yàn)室病毒注射方法。首先用異氟烷深度麻醉C57BL/6小鼠，固定于腦立體定位儀，參照小鼠大腦立體定位圖譜確定海馬CA1的位置，前囟（bregma）為原點(diǎn)（0，0，0），在bregma后2.4 mm（AP：-2.4 mm），左、各1.6 mm（ML：±1.6 mm），用1 mm直徑的顱骨鉆小心開骨窗，然后用消毒過的針頭輕輕挑開硬腦膜，使用微量注射泵作微量注射，深度為-1.65 mm（DV：-1.65 mm），注射前將微量注射器下降至-1.70 mm并停留1 min，再上抬至-1.65 mm，實(shí)驗(yàn)組注射rAAV-U6-shSpastin-CMV-EGFP-pA，對(duì)照組注射rAAV-U6-Scramble-CMV-EGFP-pA，注射量為0.3μL，速度為0.03μL/min，注射完畢后繼續(xù)留針10 min，待病毒充分?jǐn)U散后緩慢拔出，用骨蠟封閉骨窗，消毒縫合置小鼠于37℃電熱毯上至蘇醒。

3.3 Western blot參照本實(shí)驗(yàn)室Western blot方法［10］。注射病毒載體21 d后，每組隨機(jī)選取3只小鼠，異氟烷麻醉，將小鼠腦組織浸入配制好的氧飽和冷凍人工腦脊液中修塊，去除小腦組織后以橫斷面為底用瞬間粘合膠固定于振動(dòng)切片機(jī)底座，使用振動(dòng)切片機(jī)獲取5～6片300μm厚的含海馬區(qū)腦片，立即轉(zhuǎn)移至呈冰水混合物的人工腦脊液中，體視顯微鏡下參照小鼠大腦圖譜快速取小鼠海馬CA1區(qū)于EP管中，并加入細(xì)胞裂解液。剪碎腦組織并超聲破碎組織，然后低溫離心（10 000×g，10 min），取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。10%的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉1 h后，孵育兔抗spastin多克隆抗體（1∶1 000稀釋）和鼠抗GADPH多克隆抗體（1∶5 000稀釋）過夜，室溫加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶5 000稀釋），孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。用ImageJ分析條帶的灰度值，待測蛋白相對(duì)表達(dá)水平=待測蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值，GADPH為內(nèi)參照。

3.4 冰凍切片制備小鼠用異氟烷深度麻醉，冷生理鹽水經(jīng)心臟灌注，4%多聚甲醛固定。開顱取腦后4%多聚甲醛固定過夜。15%、30%蔗糖梯度脫水，Leica冰凍切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚30μm。

3.5 尼氏染色為確定重組的sh-Spastin腺相關(guān)病毒載體的表達(dá)范圍，在病毒載體注射C57BL/6小鼠海馬的CA1區(qū)表達(dá)21 d后，取冰凍切片進(jìn)行進(jìn)行尼氏染色：切好的腦片貼于玻片上晾干過夜，次日經(jīng)ddH2O洗2 s，5%甲苯胺藍(lán)水溶液處理10 s，ddH2O洗2s，經(jīng)75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水（各2 min），經(jīng)二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ（各5 min）進(jìn)行透明化，中性樹脂封片后鏡檢。

3.6 HE染色按美侖HE染色試劑盒使用說明書方法，取冰凍切片進(jìn)行腦片貼片后，室溫晾干過夜，用ddH2O洗10 s進(jìn)行水化；蘇木精染液染3 min，自來水沖洗10 s；1%鹽酸乙醇洗3 s后自來水沖洗10 min；伊紅染液染30 s，自來水沖洗30s；經(jīng)75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水（各2 min）后經(jīng)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ（各5 min）透明；中性樹脂封片后鏡檢。

3.7 高爾基染色按高爾基染色試劑盒使用說明書的方法，在注射病毒載體21 d后，用異氟烷深度麻醉處死，取腦組織于4%多聚甲醛液固定48 h，將實(shí)驗(yàn)部位（從背側(cè)海馬開始到腹側(cè)海馬結(jié)束）切成2～3 mm厚腦組織塊，加入高爾基染色液將腦組織完全浸沒，放置陰涼通風(fēng)處避光處理14 d（每隔3 d更換一次新染液），染色完成后取出腦組織塊經(jīng)15%和30%的蔗糖溶液脫水處理，經(jīng)濃氨水處理45 min，蒸餾水洗1 min，定影液處理45 min，蒸餾水洗1 min，30%的蔗糖溶液脫水處理2 d，用振動(dòng)切片機(jī)將腦組織切成100μm厚的腦片，貼于明膠玻片晾干后經(jīng)75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水（各2 min）、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ（各5 min）進(jìn)行透明，中性樹脂封片后用數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行全景多層掃描成像。

3.8 新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)參照Cohen等［11］新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)方法：將小鼠置于40 cm×60 cm×40 cm無蓋的測試箱中，適應(yīng)5 min后于測試箱內(nèi)放兩個(gè)材質(zhì)、大小、顏色均相同的圓柱體，把小鼠頭部朝向圓柱體訓(xùn)練5 min，1 h后將其中一個(gè)圓柱體換成同材質(zhì)同顏色的正方體（邊長與圓柱體直徑一樣），測試5 min，用Topscanlite 3.0軟件分析小鼠對(duì)新舊物體的嗅探時(shí)間與次數(shù)。正常小鼠對(duì)新物體有明顯偏好，表現(xiàn)為嗅探時(shí)間與次數(shù)顯著增加。

3.9 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參照Nunez等［12］的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法：水迷宮實(shí)驗(yàn)分適應(yīng)、訓(xùn)練、測試、反向訓(xùn)練和反向測試5個(gè)階段。適應(yīng)階段：第1天逃生平臺(tái)（N象限）高出水面1 cm，把小鼠面朝池壁放入S象限自由游泳尋找逃生平臺(tái)。訓(xùn)練階段：第2、3天逃生平臺(tái)位于水面下1 cm，把小鼠面朝池壁放入S象限自由游泳尋找逃生平臺(tái)，記錄逃生潛伏期。測試階段：將逃生平臺(tái)撤走，把小鼠從S象限中點(diǎn)放入池中60 s，記錄游泳軌跡，分析穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。反向訓(xùn)練階段：將逃生平臺(tái)放于E象限正中且位于水面下，測試小鼠分別從W、S的中點(diǎn)及交點(diǎn)放入池中，記錄潛伏期。反向測試階段：待測小鼠從W與S交點(diǎn)放入池中并自由游泳60 s，分析穿越新平臺(tái)所在象限的次數(shù)及在此象限的持續(xù)時(shí)間。逃生潛伏期反映小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)及持續(xù)時(shí)間則反映小鼠的空間記憶能力。

3.10 腦片電生理檢測參照Guo等［13］腦片電生理記錄方法。在rAAV病毒注射后21 d，異氟烷深度麻醉C57BL/6小鼠，用冷凍高糖人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF；含212 mmol/L蔗糖、10 mmol/L葡萄糖、26 mmol/L Na2CO3、3 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L MgCl2、1 mmol/L Ca-Cl2、15 mmol/L抗壞血酸鈉和3 mmol/L丙酮酸鈉）經(jīng)心臟灌注。打開顱骨，快速取腦轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的氧飽和高糖ACSF中，振動(dòng)切片機(jī)冠狀切片，片厚300 μm，隨后轉(zhuǎn)入氧飽和ACSF（含124 mmol/L NaCl、10 mmol/L葡萄糖、26 mmol/L NaHCO3、3 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L MgCl2和1 mmol/L CaCl2），恒溫水浴箱34℃孵育30 min，之后室溫孵育1 h備用。在電壓鉗模式下，首先分別記錄微小興奮性突觸后電流（miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC）和誘發(fā)的興奮性突觸后電流（evoked excitatory postsynaptic current，evoked EPSC）；其次通過記錄間隔100 ms的配對(duì)脈沖刺激產(chǎn)生的EPSC，分析配對(duì)脈沖比值（paired pulse ratio，PPR）即后一個(gè)刺激的EPSC/前一個(gè)刺激的EPSC的振幅比。最后在電流鉗模式下，進(jìn)行群峰電位（population spike，PS）的記錄。首先記錄一段10 min的基線（群峰電位幅值為最大幅值的30%），然后給高頻刺激（high-frequency stimulation，HFS；4個(gè)100 Hz的串刺激，間隔10 s），接著以1/15 Hz的頻率給予測試刺激記錄40 min以上的群峰電位，誘發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP；群峰電位幅值超過基礎(chǔ)電位的20%并能夠維持至少30 min）。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，組與組之間的比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05作為差異性檢驗(yàn)水平。

結(jié) 果

1 sh-Spastin可有效抑制小鼠海馬spastin的表達(dá)

圖1A顯示，經(jīng)過尼氏染色的小鼠腦切片，其海馬部位的細(xì)胞帶清晰可見，CA1區(qū)細(xì)胞帶周圍均可見綠色熒光，說明病毒載體的注射位置正確，并且均在海馬CA1區(qū)正常表達(dá)。

HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)組海馬的組織學(xué)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比無顯著變化，見圖1B；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的體重也無顯著差異，見圖1C。這說明干擾spastin的表達(dá)對(duì)海馬神經(jīng)元的形態(tài)以及小鼠的生長發(fā)育均沒有影響。

Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組海馬組織中spastin蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），說明sh-Spastin可有效干擾海馬spastin蛋白的表達(dá)，見圖1D、E。

Figure 1.The expression of spastin in hippocampus CA1 area was knocked down by sh-Spastin.A：representative schematic diagram of stereotactic injection（21 d after rAAV injection，×200）；B：HEstaining showed that spastin knockdown did not change the structure of hippocampus（×200）；C：the body weight of mice after injection of rAAV for 21 d（n=17）；D and E：the protein level of spastin in hippocampuswas detected by Western blot（n=3）.Mean±SEM.*P＜0.05 vs control group.圖1 sh-Spastin敲減海馬CA1區(qū)spastin的表達(dá)

2 干擾海馬spastin表達(dá)導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙

新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，訓(xùn)練階段對(duì)照組小鼠對(duì)兩相同物體嗅探次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（左側(cè)31.5±2.7，右側(cè)32.5±1.3，P＞0.05），嗅探時(shí)間的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［左側(cè)（30.7±3.7）s，右側(cè)（31.7±4.6）s，P＞0.05］，實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)兩相同物體嗅探次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（左側(cè)25.4±2.5，右側(cè)23.5±2.1，P＞0.05），嗅探時(shí)間的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［左 側(cè)（23.2±2.7）s，右 側(cè)（21.0±2.3）s，P＞0.05］；而測試階段對(duì)照組小鼠對(duì)新物體的嗅探次數(shù)顯著多于舊物體（新物體38.6±1.6，舊物體25.5±2.0，P＜0.05），對(duì)新物體的嗅探時(shí)間也顯著長于舊物體［新物體（40.5±2.2）s，舊物體（21.8±2.5）s，P＜0.05］，實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)新舊物體嗅探次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（新物體17.1±1.6，舊物體15.5±1.8，P＞0.05），嗅探時(shí)間的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［新物體（25.4±2.2）s，舊 物 體（22.4±2.6）s，P＞0.05］，見圖2。

Figure 2.Spastin knockdown in hippocampus reduced the preference of the mice for novel object.A：schematic diagram of novel object recognition（NOR）test；B：tracks of mice in different stages of NOR test；Cand D：the sniffing times and time of the mice for objects in training and testing stages，respectively.Mean±SEM.n=16.*P＜0.05 vs control group.圖2 海馬區(qū)spastin敲減后小鼠對(duì)新奇物體的偏好減少

水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的小鼠在適應(yīng)階段均能找到逃生平臺(tái)。在訓(xùn)練階段，相比對(duì)照組小鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠找到逃生平臺(tái)的潛伏期顯著延長［在第2天（D2），對(duì)照組（13.0±1.8）s，實(shí)驗(yàn)組（20.9±2.6）s，P＜0.05；在第3天（D3），對(duì)照組（6.1±0.8）s，實(shí)驗(yàn)組（12.7±1.5）s，P＜0.05］，見圖3B。在測試階段，與對(duì)照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠穿越逃生平臺(tái)所在象限的次數(shù)顯著減少（對(duì)照組8.1±0.8，實(shí)驗(yàn)組6.1±0.3，P＜0.05），在逃生平臺(tái)所在象限持續(xù)的時(shí)間均顯著減少［對(duì)照組（17.8±1.2）s，實(shí)驗(yàn)組（13.2±0.7）s，P＜0.05］，見圖3C～F。當(dāng)把逃生平臺(tái)轉(zhuǎn)移至新象限，實(shí)驗(yàn)組小鼠找到逃生平臺(tái)的潛伏期顯著增加［在第5天（D5），對(duì)照組（6.5±1.0）s，實(shí)驗(yàn)組（14.8±3.1）s，P＜0.05］，見圖3B。在反向測試階段，實(shí)驗(yàn)組小鼠穿越新平臺(tái)所在象限的次數(shù)顯著 減 少（對(duì) 照 組8.7±0.8，實(shí) 驗(yàn) 組6.0±0.7，P＜0.05），在目標(biāo)象限持續(xù)的時(shí)間也顯著減少［對(duì)照組（22.7±2.0）s，實(shí)驗(yàn)組（13.7±0.8）s，P＜0.05］，見圖3G～J。

3 干擾海馬spastin表達(dá)抑制樹突棘的成熟

為了明確小鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)變化的基礎(chǔ)，我們用高爾基染色觀察了海馬錐體神經(jīng)元突起及樹突棘的改變。結(jié)果顯示，干擾海馬spastin表達(dá)后，錐體神經(jīng)元樹突總長度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［對(duì)照組（1 048±98）μm，實(shí)驗(yàn)組（1 049±64）μm，P＞0.05］，神經(jīng)元樹突分支數(shù)目的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（對(duì)照組24.7±3.5，實(shí)驗(yàn)組20.1±1.3，P＞0.05），見圖4A～C；Sholl分析顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元樹突交叉點(diǎn)數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4D。進(jìn)一步分析樹突棘的密度，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，基樹突神經(jīng)元樹突棘的密度顯著降低［對(duì)照組（9.4±0.5）No./10μm，實(shí) 驗(yàn) 組（6.3±0.5）No./10 μm，P＜0.05］，頂樹突神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低［對(duì)照組（10.1±0.4）No./10μm，實(shí)驗(yàn)組（8.6±0.8）No./10μm，P＜0.05］，見圖4E、4F、4H；對(duì)樹突棘形態(tài)進(jìn)行的分析顯示，與對(duì)照組相比，基樹突成熟的樹突棘密度顯著降低［對(duì)照組（3.7±0.5）No./10μm，實(shí)驗(yàn)組（2.2±0.3）No./10μm，P＜0.05］，頂樹突成熟的樹突棘密度也顯著降低［對(duì)照組（4.9±0.5）No./10μm，sh-Spastin：（3.4±0.4）No./10μm，P＜0.05］，見圖4G、I。

Figure 3.Spastin knockdown in hippocampus led to impaired spatial memory of the mice.A：flow chart of Morris water maze test；B：line graph of escape latency of mice；Cand G：tracks of mice swimming in probe and reversal probe stages；D，E，F(xiàn)，H，I and J：target quadrant crossovers，target quadrant duration and velocity in probe and reversal probe stages.Mean±SEM.n=11-17.*P＜0.05 vs control group.圖3 海馬區(qū)spastin敲減后小鼠空間記憶能力下降

4 干擾海馬spastin的表達(dá)后突觸傳遞受損

全細(xì)胞膜片鉗記錄mEPSC的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠CA1區(qū)錐體細(xì)胞mEPSC的振幅顯著降低［對(duì)照組（15.4±1.0）pA，實(shí)驗(yàn)組（8.4±0.5）pA，P＜0.05］，頻率亦顯著降低［對(duì)照組（1.3±0.1）Hz，實(shí)驗(yàn)組（0.5±0.1）Hz，P＜0.05］，見圖5A～C。全細(xì)胞膜片鉗記錄evoked EPSC的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，evoked EPSC的最大振幅顯著降低［對(duì)照組（806±28）pA，實(shí)驗(yàn)組（476±15）pA，P＜0.05］，見圖5D、E。PPR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間PPR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（對(duì)照組1.72±0.12，實(shí)驗(yàn)組1.66±0.03，P＞0.05），見圖5F、G。

為了進(jìn)一步檢測突觸傳遞效能是否受損，我們在海馬切片上檢測了小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元的PS，以評(píng)估LTP是否受到影響。圖6A顯示了LTP檢測過程中PS記錄示意圖。高頻刺激后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)均能被誘導(dǎo)產(chǎn)生LTP，實(shí)驗(yàn)組LTP的水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見圖6B、C；LTP初始階段（高頻刺激后0～10 min），實(shí)驗(yàn)組PS的幅度與對(duì)照組相比顯著降低［對(duì)照組（176±9）%，實(shí)驗(yàn)組（124±5）%，P＜0.05］；在LTP的維持階段（高頻刺激后30～40 min），PS的幅度也顯著降低［對(duì)照組（166±6）%，實(shí)驗(yàn)組（117±2）%，P＜0.05］，見圖6D。

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過小鼠大腦立體定位注射spastin干擾病毒敲減海馬spastin的表達(dá)，在不影響小鼠自身生長發(fā)育的情況下，分析神經(jīng)元樹突棘發(fā)育異常及其失功能是否參與認(rèn)知功能障礙。實(shí)驗(yàn)首先明確了海馬CA1區(qū)干擾spastin的表達(dá)后，可導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為海馬spastin敲減的小鼠對(duì)新事物的偏好降低，空間學(xué)習(xí)記憶能力下降；然后通過形態(tài)學(xué)分析檢測到海馬錐體細(xì)胞樹突棘缺失，同時(shí)成熟的樹突棘數(shù)量減少。進(jìn)一步用腦片電生理技術(shù)記錄到海馬的突觸傳遞功能發(fā)生障礙，從而明確了干擾spastin的表達(dá)系通過抑制突觸傳遞而介導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能障礙。

編碼spastin蛋白的SPAST基因突變是導(dǎo)致HSP的重要原因［1-2］，HSP患者主要表現(xiàn)為雙下肢的運(yùn)動(dòng)功能障礙，然而復(fù)雜型HSP除運(yùn)動(dòng)障礙外，往往還伴隨著認(rèn)知功能異常，如注意力、學(xué)習(xí)記憶能力下降等［4-5］。影像學(xué)的資料顯示，HSP患者大腦出現(xiàn)皮質(zhì)萎縮、白質(zhì)變薄和脫髓鞘等病變［14-16］，提示SPAST基因突變通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙。SPAST全基因敲除的小鼠不僅表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙，而且工作記憶和聯(lián)想記憶受損［17］，為了明確HSP認(rèn)知功能障礙是否由于與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要腦區(qū)——海馬區(qū)域的失功能造成的，在本研究中我們特異性的干擾小鼠海馬區(qū)spastin的表達(dá)，結(jié)果顯示spastin敲減的小鼠新舊物體的識(shí)別能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力均降低，從而明確了HSP認(rèn)知功能障礙受海馬區(qū)spastin功能的調(diào)控。

Figure 5.Spastin knockdown in hippocampus inhibited the function of synapse.A：representative traces of mEPSC for 1 s and 10 s（left）and average traces of mEPSC（right）；Band C：cumulative probability distribution plots of amplitude and inter-event intervals of mEPSC（the bar charts inside indicated amplitude and frequency of mEPSC；n=7-11）；D and E：representative recording of evoked EPSCand input-output curves（n=7-9）；F and G：representative recording of paired pulse ratio（PPR）and bar chart of PPR（n=6-8）.Mean±SEM.*P＜0.05 vs control group.圖5 海馬區(qū)spastin敲減后突觸功能受到抑制

作為一種微管切割蛋白，spastin主要通過其AAA結(jié)構(gòu)域行使微管切割、釋放微管動(dòng)力末端的功能，從而改變神經(jīng)元突起的形成［6］。細(xì)胞水平的研究顯示，過表達(dá)spastin促進(jìn)突起分支的形成，提高樹突野的復(fù)雜性，而干擾spastin則抑制突起分支形成并降低樹突野的復(fù)雜性［18］。我們在體用病毒注射敲減小鼠海馬spastin后，并沒有觀察到樹突長度和分支的改變，而觀察到位于樹突表面的樹突棘的密度顯著降低，尤其是成熟樹突棘的密度降低最為顯著。樹突棘作為興奮性神經(jīng)元的突觸后組份，在突觸傳遞和可塑性中扮演著重要的角色。臨床上諸多神經(jīng)精神性疾病所致的認(rèn)知功能障礙，比如阿爾茨海默病、精神分裂癥、自閉癥和抑郁癥等［18-20］，都集中體現(xiàn)在樹突棘結(jié)構(gòu)和功能的改變上［21］。我們通過腦片電生理記錄到mEPSC幅度和頻率在spastin敲減后顯著降低，說明敲減spastin不僅造成了樹突棘結(jié)構(gòu)的改變也同時(shí)影響了樹突棘的功能。前期我們的研究也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)spastin可明顯增加離體培養(yǎng)神經(jīng)元mEPSC的頻率和幅度［18］，這充分說明了spastin可通過改變樹突棘可塑性參與認(rèn)知功能的調(diào)控。此外，spastin改變樹突棘可塑性可能與AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，AMPA受體是樹突棘表面重要的離子型谷氨酸受體，介導(dǎo)了90%以上的興奮性突觸后電流，研究顯示spastin的MIT結(jié)構(gòu)域與AMPA受體亞單位存在直接相互作用，而且過表達(dá)spastin可促進(jìn)AMPA受體GluA2亞單位在樹突表面的表達(dá)［18］。雖然spastin主要功能是切割微管，然而其MIT結(jié)構(gòu)域還參與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的形成以及物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)［22］，提示spastin有可能通過促進(jìn)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)改變樹突棘的結(jié)構(gòu)和功能，這有待我們后續(xù)進(jìn)一步的研究。

Figure 6.Spastin knockdown inhibited CA3-CA1 LTP in hippocampus.A：schematic diagram of population spike（PS）recording；B：representative recordings of PSbefore（Pre）and after（Post）high-frequency stimulation（HFS）；C：changes of PSamplitude（%of baseline）after a HFS，measured from control（7 cells，7 mice）or sh-Spastin（6 cells，6 mice）groups；D：PSamplitude（%of baseline）0 min to 10 min and 30 min to 40 min after HFS（n=10）.Mean±SEM.*P＜0.05 vs control group.圖6 敲減spastin后海馬區(qū)CA3-CA1突觸LTP被抑制

突觸傳遞的LTP是反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的重要指標(biāo)［23］，無論何種原因造成的樹突棘結(jié)構(gòu)和功能的改變，需最終體現(xiàn)在突觸傳遞可塑性的變化上。我們實(shí)驗(yàn)中記錄的LTP的結(jié)果顯示，干擾spastin的表達(dá)后，誘導(dǎo)出的LTP的幅度較對(duì)照組顯著降低，說明敲減spastin后樹突棘結(jié)構(gòu)和功能的改變進(jìn)一步造成了突觸傳遞效能的減弱，從而導(dǎo)致了小鼠認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。

綜合我們的結(jié)果，雖然spastin的主要功能是切割微管，然而缺失spastin改變了樹突棘的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致突觸傳遞功能受損，從而引起學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙，缺失spastin所致的突觸傳遞功能受損可能是HSP患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的原因。