PTEN基因在哮喘患者中的表達(dá)及地塞米松對(duì)其調(diào)節(jié)作用的研究﹡

倪振華 陳 果 陳清閣 王雄彪▲

1.上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海 200062；2.上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院呼吸科，上海 200062

支氣管哮喘是一種常見(jiàn)病，其患病率不低，并有逐漸增高的趨勢(shì)[1]。第10號(hào)染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基 因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與哮喘發(fā)病相關(guān)的基因[2]，目前已證明在OVA誘發(fā)的哮喘大鼠模型中，PTEN蛋白表達(dá)和活性均降低，而給予糖皮質(zhì)激素地塞米松治療能促進(jìn)PTEN的表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子的分泌[3]。但是目前關(guān)于PTEN基因與哮喘的發(fā)病關(guān)系以及地塞米松對(duì)其的調(diào)節(jié)研究主要集中在哮喘動(dòng)物上，盡管PTEN基因在人和鼠中高度同源，但是否在哮喘患者中也存在類似的關(guān)系，目前與此相關(guān)的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。因此本研究擬通過(guò)測(cè)定哮喘患者和非哮喘患者氣道黏膜組織中PTEN基因的表達(dá)變化，探討PTEN在人哮喘發(fā)病中的關(guān)系，通過(guò)采用人氣道上皮細(xì)胞A549探討地塞米松對(duì)PTEN的表達(dá)調(diào)節(jié)，揭示地塞米松治療哮喘的新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年6月～2011年6月上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院收住院的5例支氣管哮喘患者作為研究對(duì)象，其中男4例，女1例，年齡30～45歲，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者于入選前1個(gè)月內(nèi)均未使用糖皮質(zhì)激素治療。正常對(duì)照組選取住院的非哮喘患者，其中男4例，女2例，年齡30～45歲。氣道黏膜組織取自支纖鏡黏膜活檢。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)購(gòu)自Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，引物和探針由上海閃晶公司合成，熒光定量PCR試劑購(gòu)自Roche公司。人氣道上皮細(xì)胞A549購(gòu)自中科院細(xì)胞所。地塞米松購(gòu)自上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信誼制藥總廠。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測(cè)PTEN基因的表達(dá) RNA 的提取采用Qiagen公司的RNeasy Micro Kit 試劑，按說(shuō)明書(shū)操作方法進(jìn)行。cDNA合成采用Invitrogen公司SuperScript Ⅲ第一鏈合成試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作方法進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)試劑采用 Roche公司 PCR master mix，反應(yīng)條件為：94℃ 10 min，94℃30 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，ABI7300全自動(dòng)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物和探針序列 如 下：PTEN-F 5- GGGACGAACTGGTGTAATGATATG-3；PTEN-R 5- ATAGCGCCTCTGACTGGGAATAG-3；PTEN-Probe 5-fam- CCCTTTTTGTCTCTGGTCCTTACTTCCCC-tamra-3；GADPH-F 5- CCACTCCTCCACCTTTGAC-3；GADPH-R 5- ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3；GADPH-Probe：5-fam- TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-tamra-3。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人氣道上皮細(xì)胞A549用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清），在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，隔天換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液 （1×l06個(gè)/mL ）加入6孔板，2 mL/孔，培養(yǎng)24 h后給不同濃度的地塞米松處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用REST-XL軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.0作為基因表達(dá)的相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[4]，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN基因在哮喘患者中的表達(dá)情況分析

本實(shí)驗(yàn)共提取5例哮喘患者和6例非哮喘患者氣道黏膜組織的RNA，采用熒光定量PCR檢測(cè)了PTEN基因的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)REST軟件分析顯示PTEN基因在哮喘患者中的表達(dá)低于非哮喘患者（下降3.784倍），兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

2.2 地塞米松對(duì)PTEN的表達(dá)調(diào)節(jié)

分別采用不同濃度的地塞米松（10-5M、10-6M、10-7M和 10-8M）處理A549細(xì)胞24 h，提取RNA后采用熒光定量PCR檢測(cè)PTEN基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示地塞米松能上調(diào)PTEN基因的表達(dá)水平，呈濃度依賴性（P＜0.01，圖1A）。再以10-5M濃度的地塞米松分別處理A549細(xì)胞24、48、72和96 h，結(jié)果顯示隨著地塞米松處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PTEN基因的表達(dá)逐步上升，具有一定的時(shí)間依賴性（P＜ 0.01，圖 1B）。

圖1 地塞米松處理A549細(xì)胞對(duì)PTEN表達(dá)的影響，A：不同濃度的地塞米松（10-5M、10-8M）處理A549細(xì)胞24 h；B：10-5M濃度的地塞米松處理A549細(xì)胞24～96 h。與對(duì)照組比較，*P ＜0.01

3 討論

第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN）是于1997年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)PTEN不僅與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，與其他呼吸系統(tǒng)疾病，如支氣管哮喘等也有一定關(guān)系。在卵蛋白（OVA）誘發(fā)的哮喘小鼠模型中，PTEN蛋白表達(dá)和活性均降低。在給予PI3K抑制劑或PTEN腺病毒cDNA后，可明顯減少氣道炎癥[2]，即上調(diào)PTEN表達(dá)能治療哮喘。在過(guò)敏原誘發(fā)的哮喘小鼠模型給予PPAR-r促效劑或PPAR-r腺病毒后，PTEN表達(dá)上調(diào)。通過(guò)測(cè)量Akt磷酸化水平的減少發(fā)現(xiàn)該上調(diào)與PI3K活性降低有關(guān)[5]。該實(shí)驗(yàn)表明PPAR-r在哮喘發(fā)病學(xué)中，通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)而起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在哮喘患者的氣道黏膜組織中PTEN的表達(dá)也是下調(diào)的，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明PTEN在哮喘發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，PTEN可以作為哮喘治療靶點(diǎn)之一。

糖皮質(zhì)激素地塞米松在治療哮喘方面的一線作用已毋庸置疑，其可抑制多種炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的生成及釋放，降低血管通透性，提高β2受體的敏感性，對(duì)于哮喘的急性炎癥及慢性氣道重塑都有肯定的療效。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松治療哮喘大鼠后，PTEN表達(dá)明顯上調(diào)，提示地塞米松可能通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)從而發(fā)揮哮喘治療的作用。本實(shí)驗(yàn)也在人氣道上皮細(xì)胞上證實(shí)地塞米松能上調(diào)PTEN的表達(dá)，本研究結(jié)果顯示地塞米松治療哮喘的新途徑。

綜上所述，通過(guò)檢測(cè)哮喘動(dòng)物和哮喘患者中PTEN基因的表達(dá)情況揭示了PTEN在哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要作用，正向調(diào)控PTEN可能是哮喘治療的新途徑。

[1] Akinbami LJ,Moorman JE,Liu X.Asthma prevalence， health care use， and mortality: United States,2005-2009[J].Natl Health Stat Report,2011,（32）:1-14.

[2] Lee YC.The role of PTEN in allergic inflammation[J].Arch Immunol Ther Exp,2004,52（4）:250-254.

[3] 徐慧，戴元榮，曾濰顯，等. PTEN在哮喘大鼠肺部的表達(dá)及地塞米松的干預(yù)[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，8：872-877.

[4] Pfaffl MW,Horgan GW,Dempfle L. Relative expression software tool（REST）for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR[J].Nucleic Acids Res,2002,30（9）:e36.

[5] Carracedo A,Pandolfi PP. The PTEN-PI3K pathway： of feedbacks and crosstalks[J]. Oncogene,2008,27（41）:5527-5541.