HLA-DRB1等位基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎、肝硬化關(guān)聯(lián)性的臨床研究

李迎杰 李東復(fù) 魏麗娟

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化二病區(qū)，遼寧 錦州 121001)

乙型肝炎病毒 (HBV)并不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，主要通過(guò)機(jī)體一系列免疫反應(yīng)造成肝細(xì)胞的損傷，具有某些組織相容性復(fù)合體 (MHC)-Ⅱ等位基因型的人易發(fā)生HBV持續(xù)感染。本文采用順序特異引物PCR(PCR-SSP)方法，以健康人作對(duì)照，對(duì)吉林地區(qū)漢族32例慢性乙型肝炎 (CHB)患者、36例乙型肝炎肝硬化患者、34例慢性無(wú)癥狀攜帶者(ASC)的人類(lèi)白細(xì)胞抗原多態(tài)性基因 (HLA)-DRB1進(jìn)行檢測(cè)，從免疫遺傳角度探討吉林地區(qū)CHB與HLA-DRB1等位基因的相關(guān)關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 CHB組32例，其中男22例，女10例，年齡15～50〔平均(38.5±15)〕歲，臨床診斷符合CHB防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔1〕，并且排除有其他肝炎病毒感染者;乙型肝炎肝硬化組36例，男19例，女17例，年齡20～70〔平均(40±12)〕歲。均有乙肝病史，均經(jīng)肝穿活檢確診;ASC組34例，其中男18例，女16例，年齡20～60〔平均(38±12)〕歲;健康對(duì)照組39例，其中男20名，女19名，年齡20～45〔平均(30.5±10)〕歲。CHB組、肝硬化組、ASC組、健康對(duì)照組在性別與年齡方面無(wú)顯著差異，具有可比性。同時(shí)根據(jù)HBV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果，將其中的102例HBV感染者分為HBV-DNA陽(yáng)性組(≥1×103拷貝/ml)和HBV-DNA陰性組(＜1×103拷貝/ml)，比較兩組間HLA-DRB1各等位基因的頻率差異。

1.1.2 主要儀器與試劑 HERMILE E383K型高速臺(tái)式低溫離心機(jī)(德國(guó))、HYBAID PCR儀(英國(guó))、BDME20微型電泳儀(中國(guó));DNA提取試劑由AXYGEN BIOSCIENCE(原杭州維特浩生化技術(shù)服務(wù)有限公司)提供;Marker(DL2000)、dNTP、Taq酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;引物由上海(生工)生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理 分別取患者和健康對(duì)照者外周肘靜脈血5 ml，2 ml注入依地酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝管中，抗凝血顛倒混勻以備提取DNA;3 ml注入普通試管，自凝血立即以10 000 r/min離心5 min，離心后取血清測(cè)HBV-DNA載量。

1.2.2 HBV-DNA測(cè)定 取患者血清樣本以及試劑盒中的對(duì)照品100μl，分別加入0.5 ml離心管中;依次加入不同的DNA提取液提取DNA，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(試劑盒購(gòu)自深圳匹基公司，引物由該公司設(shè)計(jì)并合成)，定量PCR分析儀(美國(guó)羅氏公司)擴(kuò)增測(cè)定DNA含量。

1.2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA提取 采用全血DNA抽提純化試劑盒(AXYGEN SCIENCE)。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。基本過(guò)程:紅細(xì)胞被裂解后，被保留的白細(xì)胞經(jīng)過(guò)清洗劑及蛋白酶的處理，將DNA從核中釋放出來(lái)。然后，用蛋白清除劑清除沉淀蛋白及RNA。最后，用乙醇沉淀DNA。DNA提取后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量，A260/A280為1.65～2.0。DNA置－20℃冰箱保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 根據(jù)參考文獻(xiàn)〔2〕設(shè)計(jì)出擴(kuò)增DRB1片段的通用引物6對(duì)，選用人生長(zhǎng)激素(hGH)基因片段作為內(nèi)對(duì)照，引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。采用PCR-SSP方法進(jìn)行DRB1等位基因的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;循環(huán)參數(shù)為94℃變性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸 60 s，循環(huán) 30 次;最后 72℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下觀察HLA-DRB1等位基因表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算等位基因頻率。各組間等位基因的比較、兩組間等位基因分布的差異采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)算χ2值及P值。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 HLA-DRB1基因PCR-SSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析 見(jiàn)圖1。

圖1 HLA-DRB1基因PCR-SSP產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 HLA-DRB1等位基因在各組間分布情況比較 見(jiàn)表2，表3。CHB組HLA-DRB1*0701基因頻率為10.94%，健康對(duì)照組頻率為1.28%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HLADRB1*0701在肝硬化組基因頻率為12.50%，明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.88，P＜0.05)。健康對(duì)照組與ASC組基因頻率較高的位點(diǎn)為HLA-DRB1*0301/04(15.38%)，但與CHB組、肝硬化組相比較差異無(wú)顯著性。其他等位基因頻率其他三組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HLA-DRB1等位基因頻率在HBV-DNA陽(yáng)性組與陰性組無(wú)顯著性差異。

表2 CHB組、ASC組、肝硬化組和健康對(duì)照組HLA-DRB1等位基因分布情況〔n(%)〕

表3 HBV-DNA陽(yáng)性組與HBV-DNA陰性組HLA-DRB1等位基因分布比較〔n(%)〕

3 討論

HLA-Ⅱ類(lèi)分子主要表達(dá)在某些免疫細(xì)胞表面，作為輔助性T細(xì)胞CD4+的識(shí)別標(biāo)志之一，參與外源性抗原的遞呈。HLA的晶體結(jié)構(gòu)研究表明:Ⅱ類(lèi)α鏈和β鏈的遠(yuǎn)膜區(qū)有一個(gè)抗原結(jié)合槽，與疾病相關(guān)的關(guān)鍵性氨基酸分布其中，序列氨基酸的排列順序是由每個(gè)等位基因編碼的，由于HLA-Ⅱ類(lèi)分子等位基因的多態(tài)性，導(dǎo)致了抗原結(jié)合槽的構(gòu)象、結(jié)合及遞呈抗原肽遞呈T細(xì)胞的效率不同;HLA-Ⅱ類(lèi)分子呈遞外源性抗原肽給予CD4+T細(xì)胞，促使其活化，分化為效應(yīng)細(xì)胞(Th細(xì)胞)，分泌不同的細(xì)胞因子，發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)，影響疾病的轉(zhuǎn)歸。有研究表明CHB患者存在一定的免疫功能紊亂現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞數(shù)量失衡和活化異?！?〕。

有關(guān)HLA-DRB1等位基因多態(tài)性與疾病關(guān)系報(bào)道很多〔4～6〕，本研究以吉林地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，探討HLADRB1等位基因多態(tài)性與CHB、肝硬化及HBV復(fù)制狀態(tài)的相關(guān)性，結(jié)果表明，在吉林地區(qū)漢族人群中HLA-DRB1*0701等位基因型與CHB相關(guān)，可能是CHB易感基因或連鎖基因，與錢(qián)毅等〔7，8〕的研究結(jié)果一致，但與韓瑜〔9〕等的結(jié)果不同，可能與樣本量、地域等因素有關(guān)。HBV導(dǎo)致肝細(xì)胞損害具體機(jī)制尚不十分明確，本文研究未發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1等位基因頻率與HBV的復(fù)制狀態(tài)存在關(guān)聯(lián)。

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