中藥注射劑中吐溫80的定性定量測定研究*

吳 燕，李華龍，米亞嫻

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

吐溫80(Tween 80，聚山梨酯 80)，是一種非離子型表面活性劑，可用作乳化劑、分散劑、增溶劑或穩(wěn)定劑等，被廣泛應(yīng)用于藥物和食品[1]。很多中藥注射劑中都加入了吐溫80作為增溶劑，也有些不明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，靜脈給藥對人體可能存在毒性反應(yīng)，并有研究證明，因嚴(yán)重不良反應(yīng)被國家食品藥品監(jiān)督管理局暫停使用與審批的魚腥草注射液，其中所含輔料聚山梨酯80是引起不良反應(yīng)的重要原因之一，故中藥注射劑中吐溫80的監(jiān)控對于保證臨床用藥安全具有重要意義。

本文參考有關(guān)文獻(xiàn)，聯(lián)合采用比色法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定性判定中藥注射液中是否含有吐溫80，并采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定14批中藥注射劑中吐溫80的含量。

1 儀器與試藥

島津UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，島津LC-10ATVP 液相輸液泵，島津CTO-10ASVP 柱溫箱，島津SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，Alltech ELSD2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器，安捷倫6410 三重串聯(lián)四級(jí)桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫MassHunter 工作站；色譜柱：TSKgel G2000SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)。吐溫80對照品 (日本NOF，中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)8073670)，乙腈為色譜純，硝酸鈷、硫氰酸銨、醋酸銨、二氯甲烷均為分析純，水為去離子水。市售14種中藥注射劑包括：參麥注射液，A廠生產(chǎn)，編號(hào)1、編號(hào)2、編號(hào)3；柴胡注射液，B廠生產(chǎn)，編號(hào)4、編號(hào)5、編號(hào)6；生脈注射液，C廠生產(chǎn)，編號(hào)7、編號(hào)8、編號(hào)9；生脈注射液，D廠生產(chǎn)，編號(hào)10、編號(hào)11、編號(hào)12；香丹注射液，E廠生產(chǎn)，編號(hào)13、編號(hào)14。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1吐溫80定性研究

2.1.1硫氰酸鈷銨顯色法[2]

2.1.1.1對照品溶液的制備 精密稱取吐溫80對照品(日本NOF)約30 mg，置25 ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.1.1.2測定 精密量取對照品溶液和12種中藥注射劑各1.0 ml，分別置12 ml離心管中，均準(zhǔn)確加入二氯甲烷2.0 ml，硫氰鈷銨溶液3.0 ml，加塞，混勻，室溫放置1.5 h，每15 min振蕩1次，測定前靜置0.5 h，棄上層液，照紫外-可見分光光度法，在波長620 nm處測定下層二氯甲烷液的吸光度，用二氯甲烷作空白對照。

2.1.1.3結(jié)果判定 對照品溶液和12種中藥注射液的氯仿層均呈藍(lán)色，呈吐溫80陽性反應(yīng)。吸光度測定結(jié)果見表1。

表1 比色法吸光度值測定結(jié)果

注：10、11、12 號(hào)3批中藥注射劑廠家稱未添加吐溫80

2.1.2高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[3]

2.1.2.1色譜條件 色譜柱：TSKgel G2000SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)；以20 mmol/L醋酸銨-乙腈(90∶10)為流動(dòng)相；流速0.6 ml/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。蒸發(fā)管溫度為110 ℃，霧化氣(空氣)流速為2.3 L/min，不分流進(jìn)樣。

2.1.2.2溶液制備 ①對照品溶液的制備：精密稱取吐溫80對照品(日本NOF)適量，加水溶解并定量稀釋制成濃度約為25 mg/ml的溶液，作為儲(chǔ)備液。再精密量取儲(chǔ)備液2.0 ml，置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。②供試品溶液的制備：取中藥注射劑樣品原液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，續(xù)濾液即得。

2.1.2.3適用性試驗(yàn) 取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，按“2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，14批中藥注射劑的色譜圖中均出現(xiàn)與吐溫80對照品溶液色譜圖中吐溫80峰保留時(shí)間一致的色譜峰。色譜圖見圖1。

2.1.3高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

2.1.3.1分析條件 色譜柱：TSKgel G2000SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)；以水-乙腈(95∶5)為流動(dòng)相；流速0.3 ml/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μl。電噴霧離子化正離子full scan(全掃描)監(jiān)測；霧化氣溫度350 ℃；霧化氣流速10 L/min；霧化氣壓力172.4 kPa；毛細(xì)管電壓4 000 V；監(jiān)測離子m/z(質(zhì)荷比)范圍：100～1 600；碎裂電壓100 V。

2.1.3.2溶液制備 ①對照品溶液的制備：精密稱取吐溫80對照品 (日本NOF)適量，加水溶解并定量稀釋制成濃度約為100 μg/ml的溶液，搖勻，即得。②供試品溶液的制備：精密量取2#、8#、10#、11#和12#中藥注射劑樣品原液各5 ml，分別置100 ml量瓶中，均加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，續(xù)濾液即得。

2.1.3.3適用性試驗(yàn) 取對照品溶液和供試品溶液各2 μl，按“2.1.3.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣，記錄質(zhì)譜圖，5批中藥注射劑的總離子流圖中均出現(xiàn)與吐溫80對照品溶液總離子流圖中吐溫80峰保留時(shí)間一致的色譜峰，且其一級(jí)質(zhì)譜圖均一致。質(zhì)譜圖見圖2。

2.2吐溫80定量研究——高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法

1.吐溫 80

2.2.1色譜條件 同“2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件。

2.2.2方法學(xué)考察

2.2.2.1線性關(guān)系及最低檢出限 精密稱取吐溫80對照品適量，加水溶解并定量稀釋制成濃度約為25 mg/ml的溶液，作為儲(chǔ)備液。分別精密量取上述儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 ml，置10 ml量瓶中，分別加流動(dòng)相稀釋至刻度。精密量取上述溶液各10 μl，注入液相色譜儀，以吐溫80進(jìn)樣量的常用對數(shù)值X為橫坐標(biāo)，峰面積的常用對數(shù)值Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=1.186 9X+ 5.736 9 (r=0.998 4)。結(jié)果表明：吐溫80進(jìn)樣量在5.0～75 μg范圍內(nèi)呈良好的對數(shù)線性關(guān)系。信噪比(S/N)為3時(shí)，吐溫80的最低檢出限為13.3 μg。

2.2.2.2精密度試驗(yàn) 取濃度為3.75 mg/ml吐溫80對照品溶液10 μl，按“2.1.2.1” 項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，吐溫80峰面積的RSD為0.4%，表明其精密度良好。

2.2.2.3重復(fù)性試驗(yàn) 取D廠生產(chǎn)的“生脈注射液”三批(編號(hào)10、編號(hào)11、編號(hào)12)，照“2.1.2.2”項(xiàng)下方法分別配制供試品溶液各5份，按“2.1.2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中吐溫80含量，求得RSD(n=5)分別為2.0%、1.9%和1.9%。結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.3樣品測定 取14批中藥注射劑樣品，按“2.1.2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中吐溫80含量，結(jié)果見表2。

1.吐溫 80

表2 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定結(jié)果

3 討論

3.1方法選擇 硫氰酸鈷銨顯色法易受藥品中其他金屬離子的干擾，顏色有時(shí)會(huì)發(fā)生偏差；吐溫80的分子結(jié)構(gòu)中不含有共軛雙鍵，紫外區(qū)吸收極弱，而采用通用性蒸發(fā)光散射檢測器可獲得較好的響應(yīng)值；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法得到的總離子流圖中體現(xiàn)吐溫80的特征碎片峰。試驗(yàn)中三種方法聯(lián)合應(yīng)用，可準(zhǔn)確地判明中藥注射液中是否含有吐溫80。

3.2結(jié)果分析 本次檢測的14批中藥注射劑中，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)明含有吐溫80的為參麥注射液和柴胡注射液，未標(biāo)明的是生脈注射液和香丹注射液，其中C廠聲明在其生產(chǎn)的生脈注射液中添加了吐溫80，而D廠聲稱其生產(chǎn)的生脈注射液中未添加吐溫80。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明14批中藥注射液中均檢出吐溫80，含量0.18%～0.57%。

吐溫80作為藥物制劑中最常用的輔料之一，被中國的制藥行業(yè)廣泛應(yīng)用，其添加存在一定的隨意性。近年來，隨著含吐溫80的藥物靜脈注射劑的臨床不良反應(yīng)報(bào)道的增多，人們對其特有的生理作用可能引發(fā)的不良反應(yīng)日益關(guān)注。故建議在現(xiàn)行注射液標(biāo)準(zhǔn)中增加吐溫80的考查，對其使用范圍和用量進(jìn)行控制，減少臨床使用時(shí)不良反應(yīng)的發(fā)生，保障人民用藥安全。

1 譚瑾，宋民憲，傅超美，等.中藥注射劑標(biāo)準(zhǔn)中輔料的使用及含量測定指標(biāo)的統(tǒng)計(jì).華西藥學(xué)雜志，2008，23(3)：376

2 中國藥典.三部.2010：附錄 37

3 吳毅，梁成罡，金少鴻，等.SEC-ELSD法測定中藥注射液中聚山梨酯80的含量.藥物分析雜志，2008，28(1)：12