內(nèi)皮素受體拮抗劑對(duì)肝硬化大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響

陳 匯，許 冰

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科鄭州450052

內(nèi)皮素是一種多肽，在體內(nèi)廣泛存在，具有強(qiáng)烈的縮血管作用。已證實(shí)［1］內(nèi)皮素可通過(guò)與肝星狀細(xì)胞(HSCs)表面的內(nèi)皮素受體結(jié)合，在肝硬化門脈高壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)是一種重要的致纖維化因子，能促進(jìn)HSCs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且分泌大量以Ⅰ型膠原(Col-lagenⅠ)為代表的細(xì)胞外基質(zhì)［2-3］。該研究旨在觀察四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝硬化大鼠肝組織TGFβ1和CollagenⅠmRNA表達(dá)的變化，以及內(nèi)皮素受體拮抗劑對(duì)其表達(dá)的影響，探討內(nèi)皮素與TGFβ1在肝硬化門脈高壓形成中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CCl4，分析純，相對(duì)分子質(zhì)量153.82，北京化工廠生產(chǎn)。藥品BQ-123和BQ-788購(gòu)自Calbiochem公司。RT-PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 40只清潔級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量370～400 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(NL，n=8)，普通飼養(yǎng)，不做任何處理;其余32只制備肝硬化模型(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的CCl4，按3 mL/kg灌胃，6 d 1次，共10次)。模型組32只大鼠進(jìn)一步分為模型對(duì)照組(CCl4，n=8)、內(nèi)皮素 A 受體拮抗劑組(ETRAa，n=8)、內(nèi)皮素B受體拮抗劑組(ETRBa，n=8)和聯(lián)合治療組(ETRAa+ETRBa，n=8)，后3組內(nèi)皮素受體拮抗劑處理每天2次(間隔10 h)，分別皮下注射內(nèi)皮素受體拮抗劑 BQ-123(12.5 μg/kg，10 nmol/min)、BQ-788(15 μg/kg，10 nmol/min)以及 BQ-123+BQ-788(12.5 μg/kg+15 μg/kg，10 nmol/min)。依據(jù)前期的試驗(yàn)［4］，上述BQ-123及BQ-788的應(yīng)用劑量可使血藥峰值濃度達(dá)到10-7mol/L，此濃度將能夠產(chǎn)生最大的阻斷作用。

1.3 肝臟組織形態(tài)觀察 最后一次CCl4灌胃3 d后，禁食12 h，戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，打開(kāi)腹腔，完整切取肝臟。取部分肝組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察其病理變化。剩余肝組織置液氮保存，用于提取總RNA。

1.4 肝組織 CollagenⅠ和 TGFβ1 mRNA 測(cè)定 采用Trizol試劑提取肝組織總RNA。取肝組織總RNA 4 μg，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。CollagenⅠ、TGFβ1、GAPDH和β-actin引物序列見(jiàn)表1。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1 μL，總體積25 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán);72℃后延伸7 min。以Kodak 120凝膠成像系統(tǒng)對(duì)DNA擴(kuò)增帶進(jìn)行圖像分析，以CollagenⅠ/GAPDH 和 TGFβ1/β-actin 的比值表示 CollagenⅠ和TGFβ1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 CollagenⅠ、TGFβ1、GAPDH 和 β-actin 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析比較各組間TGFβ1和CollagenⅠmRNA的表達(dá)水平，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 NL組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞未見(jiàn)變性及壞死等病變，個(gè)別匯管區(qū)散在少數(shù)淋巴樣細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。CCl4組炎癥反應(yīng)最重，肝組織正常小葉結(jié)構(gòu)消失，肝實(shí)質(zhì)被纖維隔包繞，分割成大小不等的假小葉，可見(jiàn)較大范圍彌漫的肝損害(圖1B)。ETRAa+ETRBa組較CCl4組肝臟炎癥反應(yīng)及纖維化明顯減輕，可見(jiàn)散在分布的纖維隔以及匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)。

圖1 NL組(A)、CCl4組(B)和ETRAa+ETRBa組(C)大鼠肝臟病理改變(HE，×200)

2.2 各組大鼠肝組織TGFβ1和CollagenⅠmRNA表達(dá)的比較 結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和表2。

表2 各組大鼠肝組織TGFβ1和CollagenⅠmRNA的表達(dá)

3 討論

近年研究［5-6］發(fā)現(xiàn)HSCs在肝硬化門脈高壓的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用?；罨腍SCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，分泌大量以CollagenⅠ為代表的細(xì)胞外基質(zhì)，在肝臟纖維化增殖，尤其是肝小葉內(nèi)纖維化方面發(fā)揮重要作用。TGFβ1可通過(guò)多種信號(hào)途徑活化HSCs，激活 CollagenⅠ啟動(dòng)子，增加 CollagenⅠmRNA 的表達(dá)［7］。TGFβ1 的過(guò)度表達(dá)能增加 CollagenⅠmRNA的表達(dá)水平，且TGFβ1與CollagenⅠ蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)［8］。

在該研究中，CCl4組肝組CollagenⅠmRNA表達(dá)水平明顯升高，炎癥反應(yīng)最重。這可能提示CCl4誘導(dǎo)的肝硬化模型中，多種細(xì)胞TGFβ1 mRNA表達(dá)水平升高，合成和分泌TGFβ1增加，TGFβ1刺激HSCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟沉積，產(chǎn)生肝纖維化、肝硬化。

應(yīng)用內(nèi)皮素受體拮抗劑后，各治療組TGFβ1和CollagenⅠmRNA表達(dá)水平均低于CCl4組。其中CollagenⅠmRNA顯著降低，而TGFβ1 mRNA表達(dá)水平降低差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于肝硬化模型中，高表達(dá)的TGFβ1 mRNA主要來(lái)源于炎性細(xì)胞、活化的HSCs以及竇周細(xì)胞［8］;應(yīng)用內(nèi)皮素受體拮抗劑后，內(nèi)皮素受體拮抗劑主要阻斷了TGFβ1 mRNA的HSCs及竇周細(xì)胞來(lái)源，而高于NL組的炎性細(xì)胞持續(xù)存在。因此，TGFβ1 mRNA表達(dá)水平較CCl4組雖有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一方面，炎性細(xì)胞釋放細(xì)胞因子TGFβ1主要通過(guò)活化和分泌已合成的潛在TGFβ1來(lái)完成［9］。因此，應(yīng)用內(nèi)皮素受體拮抗劑后雖然TGFβ1 mRNA表達(dá)水平降低不明顯，但內(nèi)皮素受體拮抗劑仍可能通過(guò)阻斷TGFβ1的活化和分泌，而抑制CollagenⅠmRNA的表達(dá)，顯著減輕肝臟纖維化。

綜上所述，一方面，內(nèi)皮素受體拮抗劑可通過(guò)內(nèi)皮素途徑抑制HSCs CollagenⅠmRNA的表達(dá)，在緩解肝硬化的發(fā)生發(fā)展、門靜脈壓力的控制中發(fā)揮重要作用;另一方面，內(nèi)皮素受體拮抗劑可能通過(guò)抑制TGFβ1的活化和分泌而增強(qiáng)自身的抗纖維化作用，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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