基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)艾滋病病毒攜帶者、艾滋病患者脾肺氣虛證者尿液的代謝組學(xué)研究

謝世平 馬素娜 劉偉 陳玉龍 崔永霞 許前磊 張寧 王娟 溫冠曉

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新組學(xué)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它通過運用現(xiàn)代儀器檢測分析手段，定性或定量研究觀察生物樣本中所有可檢測的代謝產(chǎn)物的綜合表現(xiàn)，探討生物體對外源性物質(zhì)以及遺傳變異的應(yīng)答等所引起的病理生理變化反應(yīng)，將這些變化反應(yīng)與代謝信息中的生物學(xué)相關(guān)事件聯(lián)系起來，以檢測活細胞中的化學(xué)變化及其生物學(xué)意義［1］。由于其具有與中醫(yī)學(xué)整體觀、即時性相一致的特點，將成為生命科學(xué)研究者研究中醫(yī)“證”本質(zhì)的有力工具［2］。通過運用代謝組學(xué)的研究方法，尋找艾滋病患者尿液中的特異代謝產(chǎn)物，為中醫(yī)藥在診斷和防治艾滋病進展中的作用提供先進的技術(shù)支持。

1 對象與方法

1.1 對象

共納入研究對象20例，均為漢族，農(nóng)民。其中疾病觀察組12例均為來源于河南省某地區(qū)的艾滋病病毒攜帶者、艾滋病患者(HIV/AIDS)脾肺氣虛證者。健康對照組8例，均為當(dāng)?shù)亟】等恕＜膊∮^察組:男6例(50%)、女6例(50%);年齡31～40歲1例(8.3%)、41～50歲 6例(50%)、51～60歲 5例(41.7%);已婚9例(75%)、離異1例(8.3%)、喪偶2例(16.7%)。健康對照組:男4例(50%)、女4例(50%);20～30歲1例(12.5%)、31～40歲1例(12.5%)、41～50歲3例(37.5%)、51～60歲3例(37.5%);已婚7例(87.5%)、未婚 1例(12.5%)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析兩組對象一般資料差異無顯著性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用國家衛(wèi)生部2005年推薦《艾滋病診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn):有流行病學(xué)史、實驗室檢查HIV抗體陽性。

中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn):以課題組前期對HIV/AIDS患者大樣本中醫(yī)證候?qū)W的臨床調(diào)查的研究成果為基礎(chǔ)［國家自然科學(xué)基金項目(90409004):艾滋病中醫(yī)證候分布規(guī)律及證候標(biāo)準(zhǔn)建立與驗證］，擬定艾滋病中醫(yī)常見基本證候辨證標(biāo)準(zhǔn)中脾肺氣虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)證候脾肺氣虛證相關(guān)的癥狀和體征:動則氣喘、易感冒、咳痰清稀、咳聲低微、自汗、神疲乏力、惡風(fēng)寒、心慌心悸、胸悶、泄瀉、便溏、舌體胖大、舌質(zhì)淡或淡白、舌苔薄白、脈象虛或細弱等。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

疾病觀察組的納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HIV確認(rèn)試驗陽性;(2)符合《HIV/AIDS常見中醫(yī)證候診斷量表》中脾肺氣虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)辨證須經(jīng)兩名副主任中醫(yī)師以上職稱醫(yī)生診斷一致;(3)年齡在18～60歲;(4)簽署知情同意書。

健康對照組的納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HIV抗體陰性;(2)身體健康無臟器嚴(yán)重疾病或慢性病急性發(fā)作者;(3)無神志不清、癡呆、各種精神病患者;(4)非妊娠或哺乳期婦女;(5)年齡在18～60歲之間;(6)能配合調(diào)查并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)不符合以上納入標(biāo)準(zhǔn)者;(2)非因感染艾滋病所患的臟器嚴(yán)重疾病，原發(fā)性免疫缺陷，激素化療等引起的繼發(fā)性免疫缺陷，血液病，其它原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1.5 儀器及試劑

主要儀器設(shè)備:LCQ Advantage MAX電噴霧離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾科技公司);色譜柱(Agilent Zorbax C18)(150 ×2.1mm，3.1μm);高速冷凍離心機(Jouan MR23i)(法國Jouan公司);低溫冰箱(MDF5411)(日本三洋株式會社);超純水器(MiII-QSyntheSiS)(美國MiIIPore公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

主要試劑:乙腈(色譜純級，購自Merck公司);甲酸 (HPLC/SPECTRO級，購自Tedia公司);甲醇(色譜純級，購自 Merck公司);高純氮氣(純度＞99.99%);高純氦氣(純度＞99.99%)。

1.6 尿液樣品的預(yù)處理

用EP管收集正常對照組、脾肺氣虛證組和濕熱內(nèi)蘊證組研究對象的晨尿2 ml，移取1 ml尿液，4000轉(zhuǎn)/分高速離心10分鐘，取上清液。精密移取上清液 300 μl，置 1.5 ml離心管中，加入 600 μl甲醇，用混勻器混勻約10分鐘，然后高速離心10分鐘，14000 轉(zhuǎn)/分，4 ℃ 控溫，取上清液 800 μl，用0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液，低溫冰箱保存。

1.7 液相色譜—質(zhì)譜條件

(1)液相色譜條件:色譜柱為Agilent Zorbax C18(150×2.1 mm，3.1 μm);流動相:0.2%冰醋酸水—甲醇梯度洗脫(見表1);流速:0.2 ml/min;進樣盤溫度:4℃;進樣量:20 μl;柱溫:30℃;色譜圖采集時間不少于60分鐘。(2)質(zhì)譜條件:掃描方式:一級全掃描;鞘氣流速:4000 kpa;輔助氣流速:1000 kpa;噴霧電壓:4 kV;毛細管電壓:-4 V;毛細管溫度:300℃，質(zhì)荷比范圍:80～1000，采用負離子掃描模式。

1.8 液質(zhì)聯(lián)用分析方法學(xué)考察

(1)空白溶劑考察:取供試品制備所用甲醇—水(2∶1)，按照梯度洗脫條件進樣，考察空白溶劑產(chǎn)生的干擾，對數(shù)據(jù)進行分析時，扣除空白溶劑的干擾。(2)精密度試驗考察:取供試品溶液(如正常對照組10號樣本)，重復(fù)進樣6次，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，考察儀器的精密度，多次測量樣本相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD% ＜3%。(3)重復(fù)性試驗考察:取同一患者的尿液，分別制樣6份，行色譜分析，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，考察方法的重復(fù)性，RSD% ＜3%;(4)穩(wěn)定性試驗考察:取供試品溶液(如健康對照組10 號樣本)，分別于 0、1、2、4、8、12 小時穩(wěn)定電壓行色譜分析，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，考察樣品穩(wěn)定性，RSD% ＜3%。

表1 液相色譜法冰醋酸水—甲醇洗脫梯度表

1.9 數(shù)據(jù)分析

(1)經(jīng)質(zhì)譜分析儀器自帶軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)(質(zhì)荷比對應(yīng)的峰強度)Excel文件，對數(shù)據(jù)進行篩選，篩選原則為:每個證型中相同質(zhì)荷比(數(shù)據(jù)上下浮動在±1的定義為同一類物質(zhì))。(2)對所篩選出的差異結(jié)果通過SPSS 13.0軟件進行t檢驗分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)P值、各組間相同質(zhì)荷比均數(shù)(同一質(zhì)荷比對應(yīng)的不同分組中所有樣本峰強度的均數(shù))的比值(以1.5倍原則)進行篩選，篩選出差異物質(zhì)，通過比較兩組間相應(yīng)代謝產(chǎn)物的峰值明確其變化的趨勢(增多或減少)。(3)對其中有顯著差異的數(shù)據(jù)采用PCA模式識別分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

空白溶劑考察結(jié)果顯示試劑無干擾;精密度考察、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察結(jié)果表明儀器精密度良好、方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.2 指紋圖譜(見圖1～2)

2.3 t檢驗分析

從圖3可以看出在HIV/AIDS脾肺氣虛證組中質(zhì)荷比分別為 794、618、339、502、118、384 的 6 種物質(zhì)與正常組相比峰強度均減小，且相差大于1.5倍。質(zhì)荷比為 412、413、368、229、286、287、325、327、529、299、210、347、311、329、331、303、345、523、505、295、300、213、521、507、293、365 的 26 種物質(zhì)在HIV/AIDS脾肺氣虛證組峰強度明顯的高于健康對照組，相差遠大于1.5倍。兩組物質(zhì)經(jīng)t檢驗均P＜0.05，差異有明顯性。其中質(zhì)荷比為412、505、794、118、329、331 的 6 種物質(zhì)，在兩組中峰度均較高且兩組差異明顯?？赡転閮山M間的特異性物質(zhì)。

2.4 PCA分析結(jié)果

數(shù)據(jù)用正交信號校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)后進行偏最小二乘模式識別(Partial Least Squares-discriminant analysis，PLS-DA)分析。從變量散點圖(plot)中可發(fā)現(xiàn)顯著差異的變量，即為“生物標(biāo)志物”。

從圖4中可以看出:健康對照組(■所示)和HIV/AIDS脾肺氣虛證組(◆所示)兩組間能明顯的區(qū)分開，兩組之間存在顯著的差異。

從圖5中可以看出在分子量為352、388、618、562、502、159、560、384、794、109、101、118、117、125、339的離子物與其他離子相距較遠，可以認(rèn)為是艾滋病病人脾肺氣虛證組相對于健康對照組的潛在標(biāo)志物。

從圖6中可以看到:第一主成分:R2Y=0.59，Q2=0.51;第二主成分:R2Y=0.86，Q2=0.75，這說明:第一主成分代表了整體信息的程度為59%左右，預(yù)測率為51%左右;第二主成分可以代表整體樣本信息的程度為27%左右，預(yù)測率為24%左右。前兩個主成分對整體樣本信息的覆蓋程度為80%，整體預(yù)測率為75%。這可以認(rèn)為是一個很理想的模型，它對大部分的數(shù)據(jù)(主成分)都能進行解釋，且預(yù)測率較高，預(yù)測能力強，結(jié)果意義可信。

3 討論

圖5 健康對照組與脾肺氣虛組PLOT圖

中醫(yī)藥認(rèn)識疾病的方法、理論均缺乏合適的現(xiàn)代科學(xué)表達體系，目前仍是一種不能與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相兼容、相通的“語言”。要進一步實現(xiàn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國際化，其根本在于用現(xiàn)代科學(xué)語言闡釋中醫(yī)獨特的理論體系。代謝組學(xué)通過獲取體內(nèi)動態(tài)變化的綜合信息了解人體可能受影響的部位和環(huán)節(jié)，這與傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)“思外揣內(nèi)”的診治方法具有內(nèi)在的同一性，代謝組學(xué)是一種較全面的系統(tǒng)的研究技術(shù)，在方法學(xué)上具有融整體、動態(tài)、綜合、分析于一體的特點，采用代謝組學(xué)這種現(xiàn)代醫(yī)學(xué)承認(rèn)的尖端技術(shù)可以克服中醫(yī)傳統(tǒng)方法的局限，成為適合現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的重要技術(shù)手段，成為溝通中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的橋梁。而且無論是中醫(yī)的“證”還是代謝組學(xué)，研究的都是致病因素作用于人體后機體某一階段反映的病理性變化的綜合情況，二者皆從機體整體變化的角度進行評價分析，共同體現(xiàn)了即時性、整體性的特點。中醫(yī)“證”是辨證論治的起點和核心，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)可以分析中醫(yī)證候的特異性代謝產(chǎn)物或標(biāo)志物，進而促進中醫(yī)證候的客觀化和證本質(zhì)的研究，為中醫(yī)證候診斷的量化、客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化提供方法和依據(jù)［3］。

本研究運用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與主成分分析方法相結(jié)合來研究HIV/AIDS脾肺氣虛證患者與健康對照研究對象的尿液代謝輪廓的差異，結(jié)果顯示該方法能夠?qū)山M間的尿液代謝輪廓進行良好的區(qū)分(PLS-DA圖)，HIV/AIDS脾肺氣虛證患者組相對與健康對照組存在著顯著的差異物質(zhì)或物質(zhì)群(PLOT圖)?；谝嘿|(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合PCA模式識別的代謝組學(xué)的研究方法是一種可以用于研究機體復(fù)雜病理生理變化的先進的技術(shù)方法，或許可以成為揭示中醫(yī)證候本質(zhì)研究的強有力的工具。

本次研究通過探索HIV/AIDS脾肺氣虛證的代謝物質(zhì)的差異，嘗試為中醫(yī)藥在診斷和防治艾滋病進展中的作用研究提供嶄新的思路，嘗試為中醫(yī)證本質(zhì)研究，更為臨床多種疾病的診斷和防治提供新的思路和方法。

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