補陽還五湯對急性腦缺血大鼠血管新生影響的實驗研究

李 軍 王朝陽

1廣東藥學院（廣東廣州510006）

2湖北中醫(yī)藥大學（湖北武漢430065）

急性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)病，約占急性腦血管病的70%～80%，有較高的病死率和致殘率。補陽還五湯是治療缺血性腦損傷的經(jīng)典方劑，能夠降低患者的致殘率，提高生存質(zhì)量。為了研究其作用機理是否與促進腦血管新生有關，本實驗采用大腦中動脈線栓法建立急性腦缺血大鼠模型，選擇觀察補陽還五湯對急性腦缺血大鼠腦缺血區(qū)微血管密度（MVD）及腦組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表達的影響，從血管新生的角度探討該方抗腦缺血損傷的作用機理，為臨床應用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物清潔級SD大鼠100只，體質(zhì)量 250～300g，雌雄各半，購于湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.2 藥物以《醫(yī)林改錯》所載補陽還五湯的藥味和比例配制：黃芪 30g，當歸尾 10g，桃仁 10g，紅花 6g，赤芍 10g，川芎 10g，地龍（研末）6g。中藥飲片購自湖北省中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)鑒定符合2005年版《中國藥典》的規(guī)定。補陽還五湯制備：加水500mL浸泡30min，武火煎煮沸騰后改用文火加熱30min，收取1次藥液，再加水500mL煎煮，方法同前，去藥渣后用濾紙過濾，將2次藥液混合加熱濃縮至1mL藥液（含生藥1.6g），置于4℃下冷藏備用。尼莫地平片購自正大青春寶藥業(yè)有限公司，規(guī)格20mg/片，批號080102，用無菌蒸餾水溶解為0.1mg/mL溶液。CD31兔源性多克隆抗體，VEGF和bFGF兔源性多克隆抗體，SABC免疫組化試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、甲酰胺、瓊脂糖，購自Sigma公司；其他異丙醇、無水乙醇、氯仿等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物造模按照文獻［1］方法復制急性腦缺血大鼠模型。將大鼠用10%水合氯醛（1.0g/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術操作臺上，取頸正中切口，游離右側頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈。結扎頸總動脈、頸外動脈。于頸總動脈分叉部下方剪一小口，將一預先燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動脈，直到遇到輕微阻力為止，插入深度由分叉部計為（18.5±0.5）mm。固定尼龍線，依次關閉切口。假手術組僅切開皮膚、分離右側頸總動脈后即縫合。術后，腹腔注射青霉素10萬U/只，2次/d，連續(xù)3d，預防感染。室溫保持在26～30℃，手術時使用加熱墊。術后將動物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒內(nèi)，自由飲水、進食。動物于清醒后2h進行神經(jīng)功能評分，1～3分者入組，若有死亡等不足，動物隨機替補。

1.4 分組與給藥大鼠造模成功后隨機分為模型組、補陽還五湯組和尼莫地平組各10只，另設假手術組，假手術組只打開頸部皮膚，畢露頸部血管后不做其他任何處理即縫合。補陽還五湯組動物于術后第4日起按4mL/kg灌服補陽還五湯藥液，尼莫地平組灌胃給予尼莫地平溶液1mg/kg，每日1次，給藥7d。其他各組動物均給予等體積無菌蒸餾水，自由飲食、活動。

1.5 神經(jīng)功能缺損程度評分大鼠清醒后，觀察其行為學變化，神經(jīng)癥狀參照文獻［2］方法進行5級評分。評分標準：無神經(jīng)功能損傷癥狀，0分；輕度神經(jīng)功能損傷（動物前爪不能完全前伸），1分；中度神經(jīng)功能損傷（動物向癱瘓側轉(zhuǎn)圈），2分；嚴重神經(jīng)功能損傷（動物向癱瘓側傾倒），3分；不能自發(fā)行走或意識昏迷，4分。各組動物在處死前2h進行評分。

1.6 標本處理給藥后第8日取材。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3mL/100g），剪開胸腔暴露心臟，用灌注針頭刺入大鼠心臟左心室，通過心臟灌注生理鹽水150mL，然后以4%多聚甲醛PBS緩沖液300mL灌注固定，灌流維持20min，灌注效果以動物頭頸堅硬如實木質(zhì)地為佳。此時，迅速斷頭取腦，可見腦組織色白如蠟。將腦組織置入4%多聚甲醛，PBS緩沖液36h，行外固定。按冠狀切面切成2mm厚腦片6片，取自頭向尾端的第4片，采用常規(guī)方法制成5μm厚的腦切片，切片分兩組備用。

1.7 免疫組化檢測免疫組化采用SABC法，DAB顯色。每只動物取海馬部位切片5張，置于100倍物鏡下，每張切片隨機選3個視野，用Olympus Micro Image 4.0圖像處理系統(tǒng)自動計數(shù)免疫陽性細胞數(shù)，計算其平均值。MVD計數(shù)按Weidner等［3］方法進行，凡染成棕黃色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為1個血管計數(shù)，每張切片在同一皮層缺血區(qū)選擇10個視野進行微血管計數(shù)，計算出每mm2面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即微血管密度，然后求其均值。

1.8 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 對急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能和腦組織MVD的影響見表1。尼莫地平組和補陽還五湯組神經(jīng)功能評分均顯著低于模型組（P＜0.05），補陽還五湯組與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；MVD實驗結果顯示，補陽還五湯組MVD顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），補陽還五湯組與尼莫地平組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能和腦組織MVD比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能和腦組織MVD比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尼莫地平組比較，△P＜0.05。 下同。

MVD（血管數(shù)/mm2）假手術組 10 0 8.21±1.05模型組 10 2.04±0.45* 15.62±1.82補陽還五湯組 10 1.35±0.32* 24.35±2.16*△尼莫地平組 10 1.62±0.35* 18.20±1.55組 別 n 神經(jīng)功能評分（分）

2.2 對急性腦缺血大鼠腦組織VEGF和bFGF的影響見表2。VEGF在假手術組有少量表達，腦缺血后在缺血半球皮層、室旁區(qū)明顯增多；模型組VEGF陽性細胞數(shù)與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），補陽還五湯組和尼莫地平組與模型組比較顯著升高，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；補陽還五湯組與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組和補陽還五湯組腦組織bFGF陽性細胞主要分布在梗死灶周圍皮質(zhì)，梗死灶中心表達較少，假手術組大鼠大腦皮質(zhì)僅見bFGF少量表達，bFGF陽性細胞呈棕黃色；模型組缺血半球皮質(zhì)bFGF表達與假手術組比較顯著升高（P＜0.05），補陽還五湯組與模型組和尼莫地平組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織VEGF和bFGF陽性細胞計數(shù)比較 （個/mm2，±s）

表2 各組大鼠腦組織VEGF和bFGF陽性細胞計數(shù)比較 （個/mm2，±s）

與模型組比較，**P＜0.01。

組 別 n VEGF陽性細胞 bFGF陽性細胞假手術組 10 10.64±1.25** 5.72±0.85*模型組 10 44.25±2.34 9.58±1.62補陽還五湯組 10 64.62±2.20* 12.65±1.26*△尼莫地平組 10 57.64±2.25* 10.20±0.98

3 討 論

補陽還五湯出自《醫(yī)林改錯》，為清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，由黃芪、當歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，功能補氣活血通絡，主治中風偏癱，口眼歪斜，言語謇澀，口角流涎等癥。補陽還五湯一經(jīng)問世，便因其療效顯著而得到廣泛應用，備受后世醫(yī)家推崇。臨床上用于治療各種腦血管疾病，取得了令人矚目的效果［4］?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證實，補陽還五湯具有擴張血管、增加腦血流量、改善微循環(huán)、降低血液黏滯性、抑制血小板聚集、溶解血栓、對抗腦缺血后腦組織損傷等多種途徑發(fā)揮臨床作用［5-6］。

腦缺血后由于腦組織缺血、缺氧引起缺血半暗區(qū)神經(jīng)元變性、壞死，而導致神經(jīng)功能缺損，因此，盡快恢復缺血區(qū)的血液供應對缺血后神經(jīng)功能的恢復至關重要，而缺血半暗區(qū)血流的恢復有賴于側支循環(huán)的建立。血管新生是改善腦組織血流供應的一種有效方法，對中風患者的預后十分關鍵，是近年來中風研究的熱點之一［7］。在血管新生的研究中，MVD是普遍采用的能夠較直觀和有效反映新生血管的數(shù)目和側支循環(huán)建立情況的指標。實驗結果顯示，補陽還五湯組的MVD比假手術組和模型組均有所增加，表明補陽還五湯組具有促進腦梗死大鼠腦組織缺血區(qū)新血管形成的作用。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的多功能因子，參與了腦缺血后腦組織的病理修復過程。VEGF可以促血管內(nèi)皮細胞分裂增殖、增生和轉(zhuǎn)移，它在血管生成的各個階段均發(fā)揮著重要作用，是目前公認的血管新生中最關鍵的因子［8］。bFGF是一種具有強烈促增殖作用的多肽生長因子，在神經(jīng)元中含量最為豐富［9］。實驗結果顯示，補陽還五湯組可以增加大鼠腦組織VEGF和bFGF的表達，且動物神經(jīng)功能癥狀得到改善，提示補陽還五湯可促進急性腦缺血大鼠缺血區(qū)血管新生，增強腦組織VEGF和bFGF的表達，可能是其抗腦缺血的作用機制之一。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carson S，et al.Reversible middle cerebral artery：occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84.

［2］Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［3］Weidner N，Semple J，Welch，et al.Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engle J Med，1991，324（1）：1-4.

［4］蓋鳳昌.補陽還五湯在心腦血管疾病中的應用［J］.中國中醫(yī)急癥，2005，14（4）：376.

［5］李泓.補陽還五湯治療中風臨床和藥理研究進展［J］.中成藥，1996，18（3）：42.

［6］張麗萍.補陽還五湯防治腦血管疾病的藥理學研究現(xiàn)狀［J］.中國藥房，2007，18（33）：2629-2630.

［7］田兆華，劉柏炎.補陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠血管新生的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2010，18（3）：192-198.

［8］Belizon A，Balk E，F(xiàn)eingold DL，et al.Major abdom nal surgery increases plam a levels of vascular endothelial growth factor open more so than m ininally nvasive methods［J］.Ann Surg，2006，244（5）：792-798.

［9］李欣欣，戴德哉.堿性成纖維細胞因子對腦缺血的保護作用［J］.藥學進展，2003，27（1）：23-26.