針刺對大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的影響

劉麗霞 邰浩清 常加松 王長明

南京中醫(yī)藥大學（江蘇南京210046）

近年來已從成年大鼠的神經(jīng)組織中分離培養(yǎng)出多潛能神經(jīng)干細胞［1］，正常情況下，這些神經(jīng)干細胞處于“靜止”或“休眠”狀態(tài)，在損傷等特定因素的作用下其分裂、分化的潛能被激活，從而出現(xiàn)增殖現(xiàn)象［2］。本實驗以針刺作為干預因素，應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)檢測巢蛋白（Nestin）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）的表達，探討針刺對脊髓損傷后大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組SD成年雄性大鼠，體質(zhì)量250～300g，由南京中醫(yī)藥大學試驗動物中心提供。一抗Nestin、NSE和GFAP均為兔抗多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)）；抗兔生物素二抗（南京凱基生產(chǎn)）。

1.2 分組與造模將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（5只）、模型組（10只）、針刺治療組（10 只）。 10g/L 戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于手術(shù)臺上，備皮，常規(guī)消毒，無菌條件下縱行切開皮膚皮下組織，分離T9～T11棘突，切除椎板，暴露硬脊膜。假手術(shù)組徹底止血后逐層關(guān)閉切口；模型和針刺治療組采用改良Allen’s重物墜擊法，用10g自制重錘于2.5cm高度在玻璃導管引導下打擊開放的T10段脊髓，出現(xiàn)擺尾反射、雙后肢軀體回縮樣撲動即為造模成功，徹底止血后逐層縫合肌肉皮膚。各組術(shù)后1h予2萬U/kg青霉素腹腔注射，每日2次，連續(xù)3d。飼養(yǎng)于配有空調(diào)的專用室，自由飲食。每日膀胱區(qū)按壓排尿3次直至排尿反射恢復為止。

1.3 干預方式假手術(shù)組和模型組不予干預。針刺治療組大鼠取損傷平面上下各5個椎體的督脈穴和華佗夾脊穴，以毫針由上到下連續(xù)快速淺刺，不留針，每日1次。7d為1療程，共2個療程。

1.4 組織標本采集將Brdu溶于生理鹽水中，配置成1%的溶液，在處死動物前24h腹腔注射（50mg/kg），每8h注射1次，共3次，至相應(yīng)時間點取材。4%多聚甲醛心臟灌注固定，在距離損傷中心5mm的頭側(cè)和尾側(cè)取材，梯度脫水，透明，石蠟包埋，制備5μm組織切片。

1.5 免疫組化染色切片脫蠟水化，檸檬酸緩沖液中進行微波抗原修復。3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化氫酶的作用，PBS洗3次，每次2min。封閉液10%山羊血清孵育10min，倒掉液體。分別加一抗 Nestin（1∶100）、Brdu（小鼠抗大鼠單克隆抗體，1∶100）、NSE（1∶100）、GFAP（1∶100），濕盒內(nèi)孵育 30～60min，PBS 洗 3 次，每次2min，依次加入抗兔生物素化二抗（其中Brdu加入抗小鼠二抗）、鏈親和素標記HRP，各孵育10min，每步均用PBS洗3次，每次2min，DAB室溫顯色2～5min，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片，鏡檢。陰性對照用0.01mol/L的PBS代替一抗。采用形態(tài)學圖像分析軟件對組織切片進行圖像分析，每個標本隨機取4張切片，每張切片選取5個視野，以細胞內(nèi)棕黃或棕褐色顆粒為陽性，對陽性細胞進行平均灰度和平均光密度的分析。

1.6 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示。先進行方差齊性檢驗，若方差齊同，組間比較采用單因素方差分析，各組兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，采用多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗，以Nemenyi法進一步檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

見表1、表2、圖1。模型組Nestin和Brdu的表達增加，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而經(jīng)過兩周針刺治療后，治療組Nestin和Brdu的表達更為明顯，與模型組比較其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺治療組NSE的表達增加明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；針刺治療組GFAP的表達較模型組為少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Nestin、Brdu平均灰度和平均光密度比較 （±s）

表1 各組大鼠Nestin、Brdu平均灰度和平均光密度比較 （±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 平均灰度 平均光密度 平均灰度 平均光密度假手術(shù)組 5 105.60±10.56 0.39±0.04 129.07±7.27 0.30±0.03模型組 10 85.01±12.39* 0.49±0.06* 104.13±8.67* 0.40±0.04*針刺治療組 10 70.15±5.26*△ 0.58±0.04*△ 94.77±7.10*△ 0.44±0.03*△Nestin Brdu

表2 各組大鼠NSE、GFAP平均灰度和平均光密度比較 （±s）

表2 各組大鼠NSE、GFAP平均灰度和平均光密度比較 （±s）

組 別 n 平均灰度 平均光密度 平均灰度 平均光密度假手術(shù)組 5 81.04±12.83 0.52±0.07 85.40±7.74△△ 0.50±0.04模型組 10 111.59±9.30* 0.37±0.04* 60.31±4.80*△ 0.66±0.03*針刺治療組 10 95.76±7.52*△ 0.43±0.04*△ 71.20±7.57*△ 0.58±0.05*△NSE GFAP

圖1 針刺治療組陽性細胞表達圖（×400）

3 討 論

成年哺乳動物終生保留有處于“靜止”狀態(tài)的ENSCs，在某些因素作用下或者受損傷刺激時可被激活，重新進入細胞增殖周期前進一步分化為特定功能的神經(jīng)細胞［3］。脊髓損傷后ENSCs存在的微環(huán)境更適合于膠質(zhì)細胞的分化，如果能夠定向調(diào)控ENSCs向神經(jīng)元分化，減少組織屏障的形成，將可能達到利用ENSCc促進神經(jīng)通路的重建，進而治療脊髓損傷的目標［4］。

Nestin是一種中間絲蛋白，存在于神經(jīng)上皮前體細胞［5］，也存在于成年多能干前體細胞［6］，為ENSCs的常用標志。Brdu是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞增殖周期的S期嵌入細胞核的DNA，可用來標記具有增殖活性的細胞［7］。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）分別作為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的標志。本實驗研究結(jié)果顯示，針刺治療組Nestin和Brdu的表達較損傷組更加明顯，說明針刺作用于損傷后的微環(huán)境放大了促內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖分化的效應(yīng)；針刺治療組的NSE表達較之損傷組為多，而GFAP的表達卻比損傷組要少，表明針刺更傾向于誘導ENSCs向神經(jīng)元分化。但是本實驗沒有涉及到ENSCs的定位和遷移，實驗動物樣本數(shù)少，觀察時間短，有待于今后繼續(xù)的探索研究。

針刺通過何種機制誘導ENSCs增殖分化形成神經(jīng)元還不清楚。以往研究顯示針刺治療可以增加促脊髓損傷修復的神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)蛋白的表達：如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子［8］（BDNF）、神經(jīng)生長因子［9］（NGF）、成纖維細胞生長因子［10］（FGF）、層黏蛋白［11］（LN）、生長相關(guān)蛋白-43［12］（GAP-43）等；而針刺也可以干預神經(jīng)生化因素，比如降低nNOSmRNA、iNOSmRNA的表達，降低NOS的活性［13］，也可以阻斷β-EP合成釋放，對抗β-EP對脊髓繼發(fā)損傷［14］。實驗顯示上述一些因子，如FGF-2能促進脊髓損傷后大鼠脊髓內(nèi)ENSCs的增殖［15］。因此我們推測針刺可能是通過改變脊髓損傷微環(huán)境中的神經(jīng)營養(yǎng)因子和相關(guān)蛋白等物質(zhì)，從而誘導ENSCs增殖分化形成神經(jīng)元。進一步探討針刺對脊髓損傷修復的分子機制，需要后續(xù)更加深入的研究。

［1］Xiang Gao，Grigori Enikolopov，Jinhui Chen.Direct isolation of neural stem cells in the adult hippocampus after traumatic brain injury［J］.Journal of Neurotrauma，2008，25（8）：985-995.

［2］Kulbatski I，Mothe AJ，Nomura H，et al.Endogenous and exogenous CNS derived stem/Progenitor cell approaches for neurotrauma［J］.Current Drug Targets，2005，6（1）：111-126.

［3］Munoz-Torres M，Alonso G，Raya MP.Calcitonin therapy in osteoporosis［J］.Treat Endocrinol，2004，3（2）：117-132.

［4］張輝，尹宗生.內(nèi)源性神經(jīng)干細胞與脊髓損傷［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2006，22（10）：798-800.

［5］Cattaneo E，Mc Kay R.Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor［J］.Nature，1990，347（6295）：762-765.

［6］Gritti A，Parati EA，Cova L，et al.Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and selfrenew in response to basic fibroblast growth factor［J］.Neurosci，1996，16（3）：1091-1100.

［7］Romanko MJ，Rothstein RP，Levison SW.Neural stem cells in the subventricular zone are resilient to hypoxia/ischemia whereas progenitors are vulnerable［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2004，24（7）：814-825.

［8］馬睿杰，滕秀英，張力，等.電針刺激干預脊髓損傷大鼠c-fos基因和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA的表達［J］.中國臨床康復，2005，9（33）：102-104.

［9］許佳年，肖達，雎久紅.電針抗脊髓損傷的實驗研究［J］.上海針灸雜志，2003，22（55）：30-32.

［10］楊成，趙冬梅，劉同慎.督脈電針治療脊髓損傷后不同神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的時間窗特征［J］.中國臨床康復，2005，9（25）：135-137.

［11］朱政.電針對大鼠脊髓損傷后層黏蛋白表達的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，22（7）：525-527.

［12］郭家松，曾園山，陳玉玲.督脈電針治療大鼠全橫斷性脊髓損傷的實驗研究［J］.中國針灸，2003，23（6）：351-354.

［13］張志英，嚴振國.電針對脊髓損傷后一氧化氮合酶表達的影響［J］.中國臨床康復，2002，6（2）：206-207.

［14］劉潔，胡湘明，劉光國，等.針灸對兔不完全性截癱不同組織β-內(nèi)啡肽影響的動態(tài)研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2003，10（5）：282-284.

［15］Laila J，Zai，Soonmoon Yoo，et al.Increased growth factor expression and cell proliferation after contusive spinal cord injury［J］.Brain Research，2005，105（2）：147-155.