腎糖顆粒對糖尿病腎病大鼠療效的實驗研究*

傅曉駿 熊榮兵 張 婷

浙江中醫(yī)藥大學附屬金華中醫(yī)院（浙江金華321017）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病的微血管病變，是影響患者生存質(zhì)量和死亡率的重要因素。據(jù)統(tǒng)計，糖尿病腎病占糖尿病患者死亡率的60%。腎糖顆粒是金華市中醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)過長期的臨床實踐總結(jié)出的治療早期DN的有效中藥復(fù)方［1］。我們從觀察DN臨床療效指標角度切入，通過本實驗來闡述本方對大鼠DN模型的療效。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性SD大鼠70只，清潔級，體質(zhì)量（160±20）g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心代購并飼養(yǎng)，動物許可證號：SYSK（滬）-2009-0069。 在室溫（22±1）℃、相對濕度 55%±5%、光照周期12h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周后試驗。

1.2 試藥腎糖顆粒方：黃芪、水蛭粉。根據(jù)人-鼠劑量的換算，藥物經(jīng)常規(guī)煎煮過濾，濃縮至每毫升含生藥2.33g，由金華市中醫(yī)院制劑室提供。鹽酸貝那普利片（產(chǎn)品批號：x1377，北京諾華制藥有限公司）。鏈尿佐菌素（美國Sigma公司）。血糖試紙（強生公司）。24h尿蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程有限公司）。α1-MG試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。β2-MG試劑盒（原子高科股份有限公司）。尿白蛋白試劑盒，北京市福瑞生物工程公司。尿轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿視黃醇結(jié)合蛋白試劑盒（上海麥約爾生物科技有限公司）。

1.3 造模SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機取8只為正常對照組，其余為模型組。模型組給予高脂飼料（10.0%豬油、10.0%蔗糖、2.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉、77.1%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)，按文獻［2］腹腔注射STZ，每周1次，連續(xù)3周，造模完成72h后，經(jīng)尾靜脈采血測血糖，血糖≥16.7mmol/L為糖尿病模型復(fù)制成功。1周后留取大鼠即刻尿，測尿微量白蛋白及尿肌酐，當模型組的尿微量白蛋白/尿肌酐顯著高于正常對照組，即為DN造模成功，不成功則剔除。

1.4 分組及給藥造模將成功的32只大鼠隨機分為4組，每組8只。正常對照組、模型對照組分別予以2mL的蒸餾水灌胃，中藥治療組予腎糖顆粒方煎液（每毫升含生藥量2.33g）2mL灌胃，西藥治療組予鹽酸貝那普利片（蒸餾水溶解，每毫升含鹽酸貝那普利藥量0.33mg）2mL，中西藥治療組予腎糖顆粒方煎液聯(lián)合鹽酸貝那普利片（蒸餾水溶解每毫升含生藥2.33g、鹽酸貝那普利0.33mg）混懸液2mL灌胃。連續(xù)給藥8周。實驗期間各組大鼠自由攝食、飲水。

1.5 指標檢測實驗灌胃8周后，即實驗結(jié)束前1d，金屬代謝籠收集大鼠的即刻尿及24h尿液，將所收集的尿液-70℃冰箱保存，檢測24h尿蛋白定量、尿肌酐、尿α1-MG、尿β2-MG、尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）、尿視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）。其中尿 α1-MG、尿β2-MG、尿微量白蛋白采用放射免疫方法，由上海曙光醫(yī)院同位素室代測。其余指標嚴格按試劑盒說明書操作完成。開始用藥前及治療結(jié)束后，尾靜脈采血，用血糖儀及血糖試紙測定血糖。

1.6 大鼠腎組織形態(tài)的觀察處死大鼠，無菌操作取腎，去掉包膜，矢狀線正中切開，所得腎臟用10%甲醛溶液固定，取小塊皮質(zhì)，進行脫水包埋組織，連續(xù)切片，片厚4μm行HE染色。其步驟均按照說明書操作完成。并用DFC295攝像頭進行拍片觀察。

1.7 統(tǒng)計學處理各組數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，以（±s）表示，組內(nèi)比較采用單因素方差齊性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況在實驗過程中，正常對照組大鼠體質(zhì)量增加明顯，精神狀態(tài)佳，反應(yīng)靈敏，活動自如，毛色光澤，全部存活。模型對照組大鼠明顯消瘦，多飲，多食，多尿，且精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動緩慢，弓背蜷體，毛豎起無光澤，糞質(zhì)稀溏，部分出現(xiàn)肢體及皮膚感染等合并癥。各治療組也出現(xiàn)上述表現(xiàn)及合并癥，但程度較模型對照組輕。

2.2 各組24h尿蛋白定量及血糖含量比較經(jīng)8周治療后，模型對照組血糖明顯高于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組血糖均顯著降低（P＜0.05）。治療后各組大鼠24h尿蛋白定量，模型組高于正常對照組，有顯著差異（P＜0.01）；各治療組均低于模型組（P＜0.05），但各治療組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 各組血糖、24h尿蛋白定量比較 ±s）

表1 各組血糖、24h尿蛋白定量比較 ±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n 血糖（mmol/L） 24h尿蛋白定量（mg/L）正常對照組 8 7.25±0.95** 13.01±3.72**模型對照組 8 32.38±1.26* 91.77±14.33△*中藥治療組 8 24.59±1.98* 53.42±24.35**西藥治療組 8 26.10±3.51* 54.10±22.14**中西藥治療組 8 23.32±5.62* 38.34±14.18**

2.3 各組尿微量白蛋白、α1-MG、β2-MG水平比較治療后各組大鼠尿微量白蛋白、α1-MG、β2-MG，模型對照組均高于正常對照組，有顯著差異（P＜0.01）；各治療組均顯著低于模型對照組（P＜0.05），各治療組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 各組尿微量白蛋白 α1-MG、β2-MG水平比較 （±s）

表2 各組尿微量白蛋白 α1-MG、β2-MG水平比較 （±s）

β2-MG（mg/L）正常對照組 8 341.73±65.66** 0.8633±0.11** 32.83±11.22**模型對照組 8 3008.93±156.24 1.40±0.24 74.61±13.21中藥治療組 8 1017.74±260.74* 1.00±0.16 39.99±10.56*西藥治療組 8 1034.18±686.93* 1.185±0.15* 45.89±6.81*中西藥治療組 8 565.53±105.56* 0.98±0.14* 51.73±12.99*組 別 n 尿微量白蛋白（ng/L）α1-MG（μg/mL）

2.4 各組 TRF、RBP水平比較治療后各組大鼠 TRF、RBP，模型組高于正常對照組（P＜0.01）；各治療組均低于模型對照組（P＜0.01）；各治療組間比較無統(tǒng)計學意義。見表3。

表 3 各組 TRF、RBP 水平比較 （μg/mL，±s）

表 3 各組 TRF、RBP 水平比較 （μg/mL，±s）

組 別 n 尿 TRF（μg/mL） 尿RBP（μg/mL）正常對照組 8 1.46±0.19** 575.94±160.87**模型對照組 8 17.67±4.72** 1579.50±190.80**中藥治療組 8 4.60±0.06** 895.25±247.76**西藥治療組 8 6.22±0.32** 1000.39±223.39**中西藥治療組 8 2.72±0.62** 884.60±81.40**

2.5 各組大鼠腎組織形態(tài)觀察見圖1。從圖1可以看到，與正常組大鼠比較，模型組大鼠的腎小球體積明顯增大，呈現(xiàn)腎小球肥大，并且有毛細血管腔狹窄及腎小囊粘連，腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，而治療組的中藥組、西藥組及中西藥組較模型組明顯改善，沒有明顯的球囊粘連，中藥組腎小管無上皮細胞空泡。同時治療組的大鼠腎小球體積較模型組也沒有明顯的增大。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)學觀察（HE染色）

3 討 論

DN的原發(fā)病是糖尿病，屬于中醫(yī)學“消渴”范疇。消渴病日久及腎，易發(fā)生以下兩種病變：一是陰損及陽，陰陽俱虛，五臟虛弱，腎虛為主；二是久病入絡(luò)，且陰虛內(nèi)熱，耗津灼液，而致腎絡(luò)瘀滯。因此，腎虛絡(luò)瘀是其基本病機特點，益氣活血通絡(luò)乃其治療關(guān)鍵。在前期臨床研究［1］中觀察發(fā)現(xiàn)，DN患者大多數(shù)有肢體麻木、刺痛、舌質(zhì)紫暗、脈細澀等瘀血癥狀，提示DN患者體內(nèi)存在瘀血現(xiàn)象。本課題腎糖顆粒方由黃芪和水蛭組成。方中黃芪性溫，有益氣、補虛、消腫的功效，而水蛭為傳統(tǒng)的破血、逐瘀、通經(jīng)中藥。兩者合用旨在益氣活血化瘀通絡(luò)。大量的臨床和藥理研究證實，黃芪有抗血小板凝集，降低纖維蛋白原及全血黏度，增強腎血流量，改善內(nèi)臟微循環(huán)的作用。而水蛭唾液中有一種抗凝血物質(zhì)——水蛭素，能阻止凝血酶對纖維蛋白的作用，對糖尿病患者的高黏血癥療效確切［3］。水蛭還具有擴張毛細血管，增加外周血流量，改善缺血及抗血小板聚集和血栓形成的作用［4］。造模后，大鼠較正常組比較明顯消瘦，多飲，多食，多尿，且精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動緩慢，弓背蜷體，毛豎起無光澤，糞質(zhì)稀溏，部分甚至出現(xiàn)肢體及皮膚感染等合并癥。這是DN虛證的典型表現(xiàn)。而經(jīng)腎糖顆粒治療8周后，大鼠一般情況得到明顯改善，表明腎糖顆粒可改善DN大鼠的癥狀。實驗中還觀察到腎糖顆粒組大鼠的血糖、24h尿蛋白定量與模型組比較也明顯下降（P<0.05）。說明腎糖顆粒方還具降低血糖，降低24h尿蛋白定量，改善腎功能的作用，可有效的延緩DN大鼠的腎損傷。

Mongensen將1型糖尿病腎損害分為5期，其中微量白蛋白尿是診斷早期DN的主要指標，而出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿及臨床癥狀時，已達3級以上，腎病屬不可逆改變，已失去了預(yù)防和有效治療時機，故早期診斷治療十分重要。目前研究認識到糖尿病不僅會累及腎小球，而且還會累及腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)，且腎功能惡化的程度與腎小管間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)［5］。腎臟病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后轉(zhuǎn)歸過程中，腎小管間質(zhì)損害起著極其重要的作用［6］。尿微量白蛋白（mAlb）、TRF屬于腎小球性蛋白［6］，皆屬于低分子蛋白。在正常情況下，絕大部分的白蛋白、TRF均不能通過濾過膜，一旦腎小球損傷即可出現(xiàn)了腎小球性蛋白尿。α1-MG和β2-MG都是小分子量蛋白，能自由通過腎小球濾過膜濾入原尿，正常情況下，尿液中含量微乎其微。DN早期，當腎小管受損，重吸收功能減退時，尿α1-MG升高，且腎小管對α1-MG重吸收障礙先于β2-MG，在較寬的pH范圍內(nèi)（4.0～10.0）較穩(wěn)定，很少分解，而尿β2-MG不穩(wěn)定，在酸性環(huán)境極易分解。因而尿α1-MG更能反映腎小管早期損傷，對早期DN的診斷價值更高，是極有價值的腎小管損傷標志性蛋白［8］。而尿視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）是一種相對分子質(zhì)量21kD的小分子蛋白質(zhì)，當腎小管重吸收功能異常時，尿中RBP水平顯著增加。目前認為RBP是最敏感反映腎近曲小管損傷的指標。本實驗中不但模型組大鼠的尿微量白蛋白和TRF均顯著高于正常對照組；同時實驗結(jié)果還顯示模型組DN大鼠尿α1-MG、尿β2-MG及尿RBP較正常對照組比較均呈顯著升高。說明DN早期不僅存在腎小球損傷，產(chǎn)生了腎小球性蛋白尿，腎小管功能也受到一定程度破壞。通過治療干預(yù)8周后顯示，腎糖顆粒組DN大鼠尿微量白蛋白及TRF與模型組比較均分別呈顯著下降趨勢；同時腎糖顆粒組DN大鼠尿α1-MG、尿β2-MG及尿RBP較模型對照組比較也都顯著降低。由此表明腎糖顆粒方不僅扭轉(zhuǎn)了DN大鼠的腎小球病變，同時也在一定程度上改善了腎小管的重吸收功能，從而延緩了腎臟的進一步損傷。

有學者認為在DN早期階段進行有效干預(yù)治療，仍有希望防止DN向大量蛋白尿發(fā)展［9］。我們的實驗也證實了這一點。如前所述，本實驗通過腎糖顆粒方的干預(yù)有效地降低了DN大鼠的蛋白尿，改善了DN大鼠的一般狀況，從而延緩了DN微量白蛋白尿向大量蛋白尿的進展，延緩了腎損害。

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