大鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪模型的制備

李昕華

(長(zhǎng)春市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 長(zhǎng)春 130000)

短暫的輕度缺血即可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)免疫感受和效應(yīng)細(xì)胞[1],對(duì)保護(hù)腦組織有重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用體外氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型來(lái)模擬腦損傷過(guò)程,為研究缺血過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞的腦保護(hù)作用提供了可靠、實(shí)用的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生1～2d Wistar大鼠。購(gòu)自吉林大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定 采用酶消化法結(jié)合機(jī)械分離法進(jìn)行培養(yǎng)[2]。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察不同時(shí)期細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。在培養(yǎng)第8天用OX42免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。

1.2.2 制備小膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型及評(píng)價(jià) (1)缺氧DHank’s液的制備及缺氧罐的制作。方法同前期研究[3]。(2)小膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型的建立及LDH漏出率測(cè)定。用缺氧D-Hank’s液洗滌并孵育培養(yǎng)至第8天的小膠質(zhì)細(xì)胞,在缺氧罐中37℃培養(yǎng);取缺氧時(shí)間為30、60、120、180min再?gòu)?fù)氧24h的細(xì)胞檢測(cè)LDH漏出率,方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

小膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)第8天分化成熟,OX42陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(97.33±2.15)%。

2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型制備及評(píng)價(jià)

血?dú)夥治鰞x測(cè)量缺氧D-Hank’s液氧濃度＜1%,抽成真空及通入缺氧氣體后缺氧罐內(nèi)氧含量為(1±0.1)%,二氧化碳濃度為(5±0.1)%。小膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,OGD60min之后與30min比較LDH漏出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)表1。

表1 LDH漏出率[（n=48，%）,(±s)]

表1 LDH漏出率[（n=48，%）,(±s)]

注：▲P<0.05 小膠質(zhì)細(xì)胞15min;#P<0.05 小膠質(zhì)細(xì)胞45min

0min 30min 60min 120min 180min小膠質(zhì)細(xì)胞 0.95±0.05 (4.81±0.39)▲ (17.08±1.08)# (29.04±1.96)# (36.38±1.76)#

3 討論

采用OX42免疫細(xì)胞化學(xué)染色后,小膠質(zhì)細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈細(xì)長(zhǎng)或橢圓形,從胞體發(fā)出細(xì)長(zhǎng)而有分支的突起,表面有許多小棘突,97%以上細(xì)胞為OX42陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)可在培養(yǎng)第8天可分離出高純度的成熟小膠質(zhì)細(xì)胞。

目前有多種腦缺血模型制備方法及操作手段[4],本實(shí)驗(yàn)用自行設(shè)計(jì)生產(chǎn)的缺氧系統(tǒng)培育成熟的小膠質(zhì)細(xì)胞,建立OGD模型,隨OGD時(shí)間增加,小膠質(zhì)細(xì)胞損傷逐漸增加,OGD60min后損傷明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的OGD方法可明顯造成小膠質(zhì)細(xì)胞缺血、缺氧性傷害,可成功模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷。

[1]Bayer AU,Keller ON,Ferrari F,et al.Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death,Alzheimer's disease and Parkinson's disease[J].Am J Ophthalmol,2002,133,1:135～137.

[2]Simon Moussauda,b,Henning Joerg Draheimb.A new method to isolate microglia from adult mice and culture them for an extended period of time[J].Journal of Neuroscience Methods,2010,187:243～253.

[3]莽靖,李昕華,閻世軍,等.大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)、鑒定及氧糖剝奪模型的建立[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2010,6:790～791.

[4]Zhang J,Qian H,Zhao P,et al.Rapid hypoxia preconditioning protects cortical neurons from glutamate toxicity through delta-opioid recepto[J].Stroke,2006,37:1094～1099.