甲基強(qiáng)的松龍對(duì)脊髓損傷大鼠下丘腦視上核FOS、NOS表達(dá)的影響

李雪甫，傅玉峰，王永實(shí)，陳 培，丁 炯，肖 明

(1淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇淮安223300;2南京醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室)

脊髓損傷(SCI)不僅引起損傷局部神經(jīng)組織變性壞死、空洞形成和膠質(zhì)瘢痕形成，還可累及傳導(dǎo)束，導(dǎo)致腦內(nèi)運(yùn)動(dòng)中樞和內(nèi)臟心血管活動(dòng)核團(tuán)內(nèi)神經(jīng)元萎縮、變性壞死，造成繼發(fā)性損傷與內(nèi)臟、心血管功能紊亂［1］。2009年10月～2010年10月，我們觀察了甲基強(qiáng)的松龍(MP)對(duì)急性脊髓損傷(SCI)大鼠下丘腦視上核神經(jīng)元FOS和一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)的影響，旨在為SCI臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠12只(南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量200～300 g。將12只SD大鼠隨機(jī)分為治療組、損傷組、對(duì)照組各4只。主要試劑:硝基四氮唑藍(lán)(NBT，美國(guó) Sigma公司);β-NADPH(美國(guó)Sigma公司);兔抗大鼠FOS(美國(guó)Sigma公司);含生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及干預(yù) 治療組和損傷組采用橫斷法制作 SCI模型［2～4］，對(duì)照組為假手術(shù)組，治療組術(shù)后立即靜注MP 30 mg/kg，損傷組和對(duì)照組靜注相同劑量生理鹽水，三組均持續(xù)4周。

1.2.2 FOS、NOS表達(dá)檢測(cè) 三組分別于術(shù)后1 d、1周、4周常規(guī)左心室灌注，取含下丘腦視上核的組織，固定后置入含30%蔗糖的0.01 mol/L PBS，4℃過(guò)夜。Leica恒冷箱冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，片厚30 μm，隔5張取2張，分2套收集于0.01 mol/L PBS內(nèi)。一套行尼氏染色進(jìn)行核團(tuán)定位;另一套行NADPH-d組織化學(xué)及FOS免疫組織化學(xué)染色［5］。切片在反應(yīng)液［0.1 mol/L PB(pH 8.0)，含 0.3%TritonX-100，0.6 g/L NBT，0.5 g/L β-NADPH］中 37℃避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS充分洗滌，置入含兔抗大鼠 FOS(1∶3 000)0.01 mol/L，pH 7.4 PBS 中37℃孵育2 h;漂洗后，入含生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG液(1∶100)，37 ℃孵育30min;反復(fù)漂洗后，行ABC法顯色，0.01 mol/L PBS終止反應(yīng)。貼片、風(fēng)干、脫水、透明、封片。另選1只正常大鼠，灌注后取腦、切片，取含下丘腦視上核的切片，行免疫組化空白對(duì)照試驗(yàn)。圖像分析和數(shù)據(jù)處理:根據(jù) Paxino和Watson大鼠腦圖譜對(duì)尼氏染色切片上的下丘腦視上核進(jìn)行定位，以確定該核團(tuán)的主部。用Leica圖像分析系統(tǒng)對(duì)相應(yīng)的FOS免疫組化和NADPH-d組織化學(xué)染色切片進(jìn)行顯微攝像;每只大鼠統(tǒng)計(jì)4張切片，計(jì)數(shù)核團(tuán)的主部FOS陽(yáng)性細(xì)胞和NOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。FOS陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核著色，呈棕黃色;NOS陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)著色，呈紫藍(lán)色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。細(xì)胞計(jì)數(shù)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采取雙盲法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

各組FOS、NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較見(jiàn)圖1，由圖1可見(jiàn)損傷組1 d FOS、NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，治療組1、4周的FOS、NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于損傷組(P均＜0.05)。

圖1 各組FOS、NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS在包括神經(jīng)元在內(nèi)的絕大多數(shù)正常細(xì)胞中均有低水平的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和功能活動(dòng)至關(guān)重要。FOS屬于即刻早期基因，中樞神經(jīng)細(xì)胞受到特異性刺激后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)FOS將快速表達(dá)，F(xiàn)OS蛋白大量合成并迅速堆積于胞核。通過(guò)表達(dá)和整合信息、作用于目的基因改變其轉(zhuǎn)錄水平而發(fā)揮細(xì)胞核內(nèi)第二信使的作用。少量FOS參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和損傷修復(fù)的調(diào)節(jié);而大量FOS表達(dá)對(duì)神經(jīng)元有損傷作用。NOS是催化左旋精氨酸與分子氧生成的NO關(guān)鍵酶，同時(shí)也是生成的NO限速酶。其廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)，其同功酶有三種亞型，即在正常狀態(tài)下表達(dá)的神經(jīng)元型NOS和內(nèi)皮型NOS以及在損傷后誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)型NOS。來(lái)源于誘導(dǎo)型NOS和神經(jīng)元型NOS的NOS有神經(jīng)毒性作用，來(lái)源于內(nèi)皮型NOS的一氧化氮有神經(jīng)保護(hù)作用。正常情況下，下丘腦視上核內(nèi)部有少量NOS陽(yáng)性神經(jīng)元，可催化左旋精氨酸生成 NO［6］。在傷害性刺激等狀態(tài)下，NOS mRNA表達(dá)增強(qiáng)，由NOS產(chǎn)生大量NO對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用［7］。

MP是目前經(jīng)研究證實(shí)治療急性SCI、改善神經(jīng)功能的有效藥物［8，9］。MP對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用的主要原理為減少脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)局部血液循環(huán)，維持損傷早期的能量代謝。MP可抑制SCI后炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括 IL-6、IL-1α、IL-1β和腫瘤壞死因子，抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)神經(jīng)的生存能力。本研究損傷組1 d FOS、NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，治療組1、4周的FOS、NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于損傷組，提示MP對(duì)SCI后下丘腦視上核神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

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