放療對(duì)耳蝸組織結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物/抗氧化酶的影響

謝利紅，唐安洲，尹時(shí)華，譚頌華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，感音神經(jīng)性耳聾為其常見并發(fā)癥［1］，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。有學(xué)者認(rèn)為，放療后早期發(fā)生的感音神經(jīng)性耳聾，可能為放療后脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的一系列自由基反應(yīng)導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡［2］。2010年，我們觀察了放療后豚鼠內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變以及耳蝸脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)及抗氧化物酶超氧化物歧化酶(SOD)活力，為探討感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 白化豚鼠66只，體質(zhì)量250～350 g，雌雄不拘。電耳鏡檢查無中耳感染，耳廓反應(yīng)靈敏。隨機(jī)分為觀察組60只和對(duì)照組6只，觀察組右耳為照射耳。豚鼠喂養(yǎng)方法:自由飲水進(jìn)食，室溫23～26℃。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 觀察組用1%戊巴比妥鈉(3.5 μl/g)麻醉固定后，用GWXJ80型60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)對(duì)右側(cè)耳顳部行一次性60Co照射70 Gy，輻射深度2.0cm，照射范圍為2cm ×2cm，源皮距 80cm，自制鉛板遮蓋非照射部位。對(duì)照組不予照射。

1.2.2 耳蝸組織結(jié)構(gòu)觀察 觀察組分別于放療后1、4、7、14 和30 d 用1% 戊巴比妥鈉(3.5 μl/kg)麻醉后，斷頭經(jīng)腹側(cè)取聽泡，暴露耳蝸并在蝸尖鉆孔，推鐙骨底板脫位，刺破圓窗膜，用4%多聚甲醛固定液灌流固定后，再放入固定液4℃固定24 h以上。用10%EDTA脫鈣10～14 d，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，耳蝸中軸切片。石蠟切片脫蠟和水化，蘇木精染液染色10min，1%鹽酸乙醇分色，流水沖洗10min藍(lán)化，0.5%伊紅染液染色1min，依次經(jīng)70%、85%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，封片。光學(xué)顯微鏡下(×400倍)觀察照射耳蝸結(jié)構(gòu)變化。

1.2.3 耳蝸組織MDA含量和SOD活性測(cè)定 取出－80℃冰箱保存的每只豚鼠的右側(cè)耳蝸，置于微型玻璃勻漿器中，先加入0.5 ml生理鹽水，于冰上研磨約15min后將勻漿液倒入1 ml的EP管中。再用0.4 ml生理鹽水沖洗玻璃勻漿器，洗液一并倒于EP管中。4℃離心，4 000 r/min離心15min。離心后取出上清液到另外一個(gè)EP管中，用于MDA水平和SOD活力測(cè)定。耳蝸組織MDA水平和SOD活力的測(cè)定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用單因素方差分析進(jìn)行分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳蝸組織結(jié)構(gòu)變化 光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)對(duì)照組耳蝸組織結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)變性退化等異常改變，而觀察組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGC)放療后各時(shí)點(diǎn)均出現(xiàn)了不同程度損傷，表現(xiàn)為耳蝸SGC萎縮(細(xì)胞質(zhì)減少、細(xì)胞核濃縮凝集、缺失或者整個(gè)細(xì)胞缺失)，Corti器退化萎縮(內(nèi)外毛細(xì)胞缺失逐漸加重，尤其是外毛細(xì)胞損害更明顯);放療后第4天血管紋可見輕微的充血水腫，第7、14天逐漸加重，第30天出現(xiàn)明顯的血管紋損傷(明顯的水腫或空泡形成)，隨放療時(shí)間延長，損傷更加明顯。

2.2 耳蝸組織MDA含量和SOD活性 見表1。

表1 兩組耳蝸組織MDA水平、SOD活性變化(n=8，±s)

表1 兩組耳蝸組織MDA水平、SOD活性變化(n=8，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)觀察組放療第1天 14.08± 2.90△ 0.49±0.10*放療第4天 11.83± 2.74△ 0.66±0.26△放療第7天 11.30± 2.98△ 0.88±0.30△放療第14天 8.70± 1.29△ 0.84±0.13△放療第20天 11.81± 1.60△ 1.08±0.32△對(duì)照組41.61 ±26.49 0.24 ±0.09

3 討論

放射治療是鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段之一，感音神經(jīng)性耳聾為其常見并發(fā)癥，尤其是近年來以鉑類為基礎(chǔ)的化療配合放射治療在鼻咽癌中的廣泛應(yīng)用，感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生率明顯升高［3］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳所受的輻射劑量與感音神經(jīng)性耳聾有顯著的相關(guān)性［4］，放療后內(nèi)耳損傷呈劑量相關(guān)性［5］，放療后內(nèi)耳基底膜細(xì)胞的損傷嚴(yán)重程度依次為外毛細(xì)胞＞內(nèi)毛細(xì)胞＞柱狀細(xì)胞［6］。豚鼠耳顳部放療后數(shù)小時(shí)即可出現(xiàn)耳蝸細(xì)胞損傷［7］，表現(xiàn)為螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞萎縮或消失，毛細(xì)胞缺失，血管紋的萎縮等表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，放療后第1天即可見螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)減少，放療后第14天Corti出現(xiàn)明顯的萎縮，放療后第30天可見明顯的水腫和空泡形成。

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，電離輻射致組織細(xì)胞損傷的可能機(jī)制是［8，9］:一方面輻射直接損傷 DNA 等生物大分子;另一方面，機(jī)體內(nèi)富含大量的水，電離輻射作用于生物分子的周圍介質(zhì)(主要是水)生成水射解的大量ROS、自由基，產(chǎn)生間接損傷DNA等生物大分子。其中以后者占主要作用。MDA和SOD是反映機(jī)體氧化和抗氧化的重要指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者在放療結(jié)束時(shí)，血漿SOD活力降低，MDA含量升高［10］。體外研究發(fā)現(xiàn)，小鼠耳蝸細(xì)胞系在放療后1 h即產(chǎn)生活性氧［2］，活性氧呈劑量相關(guān)性，20 Gy劑量放療后耳蝸細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生比5 Gy的輻射量要明顯增多。認(rèn)為活性氧是引起細(xì)胞凋亡的重要觸發(fā)因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，在其它非放療引起的耳蝸細(xì)胞損傷中，活性氧起到重要作用［11］，認(rèn)為活性氧通過影響線粒體的滲透壓，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，活化p53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，放療后SOD活力明顯下降，MDA水平較放療前增加，并在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為耳蝸細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，這些結(jié)果間接反映了活性氧在電離輻射對(duì)耳蝸損傷中起到重要的作用。因而推測(cè)，放療導(dǎo)致耳蝸產(chǎn)生過多的活性氧，活性氧又引起脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，其產(chǎn)物MDA水平增加，對(duì)耳蝸起到保護(hù)作用的抗氧化物酶SOD活力降低，從而引起耳蝸細(xì)胞損傷。

綜上所述，放療導(dǎo)致的耳蝸細(xì)胞損傷及MDA升高、SOD下降在感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生中起重要作用。

［1］Ondrey FG，Greig JR，Herscher L.Radiation dose to otologic structures during head and neck cancer radiation therapy［J］.Laryngoscope，2000，110(2):217-221.

［2］Low WK，Tan MG，Sun L，et al.Dose-dependant radiation-induced apoptosis in a cochlear cell-line［J］.Apoptosis，2006，11(12):2127-2136.

［3］Low WK，Toh ST，Wee J，et al.Sensorineural hearing loss after radiotherapy and chemoradiotherapy:a single，blinded，randomized study［J］.J Clin Oncol，2006，24(12):1904-1908.

［4］Bhandare N，Antonelli PJ，Morris CG，et al.Ototoxicity after radiotherapy for head and neck tumors［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2007，67(2):469-479.

［5］范靜平，陸書昌.Y射線和噪聲對(duì)內(nèi)耳損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華耳鼻咽喉科雜志社，1992，27(3):153-155.

［6］王中和，胡海生，蔡以理.60Coγ射線照射對(duì)豚鼠耳蝸功能和結(jié)構(gòu)的影響［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1994，14(3):155-157.

［7］Enver A，Mustafa V，Ozan K，et al.Effects of piracetam supplementation on cochlear damage occuring in guinea pigs exposed to irradiation［J］.Biol Pharm Buil，2006，29(7):1460-1465.

［8］張海東，王仁生.放射治療所致活性氧簇對(duì)正常組織的損傷及其防治［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(20):2728-2729.

［9］姜梁，黎萬榮.頭頸部腫瘤放射治療后耳副反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.中國輻射衛(wèi)生，2008，17(1):117-119.

［10］湯春園，秦劍，王仁生.腫節(jié)風(fēng)提物抗放射誘導(dǎo)氧化損傷的臨床觀察［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，29(10):883-887.

［11］Labbe D，Teranishi MA，Hess A，et al.Activation of caspase-3 is associated with oxidative stress in the hydropic guinea pig cochlea［J］.Hear Res，2005，202(1-2):21-27.

［12］Rybak LP，Whitworth CA.Ototoxicity:therapeutic opportunities［J］.Drug Discov Today，2005，10(19):1313-1321.