關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中IL-4、IL-10表達(dá)的檢測(cè)

范雪亮 肖金魚

解放軍第二五一醫(yī)院（河北張家口075000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是以四肢小關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征，伴有滑膜纖維母細(xì)胞增生，大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)的一種常見的自身免疫性疾病。目前RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但其典型的病理學(xué)特征為滑膜組織異常增生，其中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)持續(xù)作用于病變部位是導(dǎo)致病變侵蝕進(jìn)展的主要原因之一。細(xì)胞因子通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用引起組織損傷酶的釋放，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，是RA炎癥和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)。在諸多參與RA炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子中白細(xì)胞介素-4（IL-4）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）是少有的抑制炎癥因子，在RA類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中受到抑制[1]。本實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)檢測(cè)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型血清中IL-4和IL-10，以探討其在動(dòng)物模型中的表達(dá)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（150±30）g，合格證號(hào)：0172808，購(gòu)于河北北方學(xué)院動(dòng)物室；飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，全年溫度21～24℃，相對(duì)濕度40%～67%。

1.2 試劑與儀器 弗氏完全佐劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；大鼠IL-4和IL-10 ELISA試劑盒均為美國(guó)Headquarters公司產(chǎn)品。TDL80-2B離心機(jī)，EL301strip reader酶標(biāo)儀購(gòu)于自美國(guó)Bio Tek公司。756MC型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 分組與造模 30只wistar大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（10只）、模型組（20只）。造模根據(jù)文獻(xiàn)[3]方法加以改進(jìn)，正常條件飼養(yǎng)10d后，將弗氏完全佐劑搖勻后，按0.1mL/只注于模型組大鼠右后肢足跖內(nèi)造模。

1.4 病理組織學(xué)檢查 造模30d后取模型組5只大鼠的踝關(guān)節(jié)，經(jīng)固定、脫鈣石蠟包埋、切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察局部組織病理學(xué)變化。

1.5 影像學(xué)檢查 造模20d后取5只大鼠（用苦味酸做標(biāo)記），每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉，行大鼠四肢關(guān)節(jié)X線攝片，觀察關(guān)節(jié)破壞情況。30d后在取相同大鼠重復(fù)操作，觀察關(guān)節(jié)破環(huán)情況。

1.6 模型評(píng)價(jià) 大鼠生長(zhǎng)情況：普通實(shí)驗(yàn)天平稱體質(zhì)量，造模前稱1次，造模后每?jī)扇諟y(cè)量1次，記錄動(dòng)物生長(zhǎng)情況。同時(shí)仔細(xì)觀察動(dòng)物的毛色、精神狀態(tài)及關(guān)節(jié)癥狀的變化。大鼠關(guān)節(jié)足腫脹：注射弗氏完全佐劑后，用容積法排水法測(cè)量雙后肢的足腫脹度。造模前觀察1次，后每周觀察1次，觀察足爪腫脹情況。同時(shí)對(duì)其他3只足爪炎癥進(jìn)行評(píng)分。采用4分制的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每只大鼠的最高分為16分，記錄并比較20d時(shí)，對(duì)照組和造模組關(guān)節(jié)炎指數(shù)和雙后肢足腫脹度平均值差異。IL-4、IL-10含量：用10%水合氯醛（3.5mL/kg）麻醉大鼠，開胸使心臟暴露，進(jìn)行心臟取血，全血2500r/min離心20min，取血清-20℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)IL-4、IL-10，具體操作按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 模型組大鼠體質(zhì)量明顯減輕，關(guān)節(jié)紅、腫，以對(duì)稱性后肢關(guān)節(jié)為主，累及踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、趾間關(guān)節(jié)等。20d左右出現(xiàn)第1個(gè)炎癥高峰，然后紅腫有一定程度消退；30d左右達(dá)到第2個(gè)高峰，進(jìn)入慢性期，紅腫逐漸消退逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形以至功能障礙，表明慢性、對(duì)稱性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。

2.2 大鼠模型雙后肢足腫脹度 見表1。實(shí)驗(yàn)第14日，大鼠關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)腫脹，而后足首先出現(xiàn)紅腫，后逐漸延伸至前足并日趨嚴(yán)重，20d腫脹達(dá)到最高值后逐漸減輕，模型組與對(duì)照組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組組大鼠雙后肢足腫脹度比較 （±s）

表1 兩組組大鼠雙后肢足腫脹度比較 （±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05。 下同。

組 別 n 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 關(guān)節(jié)體積（cm3）對(duì)照組 10 0.90±0.73 7.15±0.23模型組 10 7.29±1.82* 13.81±1.63*

2.3 大鼠模型雙后肢X線表現(xiàn) X線片顯示模型組大鼠以雙后肢改變?yōu)橹鳎?0d時(shí)隱約可見骨質(zhì)疏松，關(guān)節(jié)間隙模糊，30d時(shí)X線片可見明確的關(guān)節(jié)間隙模糊、變窄。 而對(duì)照組大鼠雙踝關(guān)節(jié)同時(shí)點(diǎn)比較，變化不大，無明顯骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)間隙清晰、未見骨質(zhì)破壞。

2.4 大鼠模型炎性足爪組織病理學(xué)改變 造模30d后，模型組大鼠節(jié)腔滑膜層次增多可達(dá)6～8層，甚至10余層，且排列不規(guī)整，滑膜內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，且在關(guān)節(jié)軟骨附近有血管翳形成，引起關(guān)節(jié)軟骨和骨組織破壞。

2.5 大鼠模型外周血IL-4和IL-10的表達(dá) 見表2。模型組IL-4和IL-10水平較對(duì)照組均明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組大鼠炎性細(xì)胞因子水平比較 （ng/L，±s）

表2 兩組大鼠炎性細(xì)胞因子水平比較 （ng/L，±s）

組別 n IL-4 IL-10對(duì)照組 10 124.82±16.77 59.00±16.85*模型組 10 67.00±8.55* 29.11±27.59*

3 討 論

IL-4能調(diào)節(jié)多種不同類型細(xì)胞的活性，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的活性，控制炎癥反應(yīng)。IL-4通過提高mRNA的降解率來抑制促炎性細(xì)胞因子的合成；IL-4還有保護(hù)軟骨和關(guān)節(jié)下骨及其他關(guān)節(jié)組織完整性的作用，主要通過減輕由INF、IL-1和LPS造成的蛋白多糖的破壞而起作用[2]。另外，IL-4能上調(diào)IL-1Ra的產(chǎn)生，刺激單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生可溶性Ⅱ型IL-1R、可溶性 TNF；同時(shí)IL-4可減少單核細(xì)胞MHC分子和共刺激分子的表達(dá)、NO的合成、PGE2的產(chǎn)生。IL-4能使Th1/Th2型細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和引導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG1、IgG4、IgE 抗體，還可協(xié)同 IL-10 抑制 Th1 細(xì)胞反應(yīng)[5]。 這些現(xiàn)象表明，IL-4在RA的發(fā)病過程中通過抑制細(xì)胞反應(yīng)和抑制促炎性細(xì)胞因子而起抗炎作用。IL-10通過抑制核因子κB進(jìn)而抑制 Th1細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-α、IL-2、IFN-γ；IL-10可降低單核細(xì)胞HLA-DR抗原和 B7等協(xié)同刺激分子的表達(dá)，抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活性；抑制NO合成和PGE2產(chǎn)生[6]。在正常情況下，炎癥因子和抗炎因子處于一個(gè)平衡狀態(tài)，如有外界原因使抗炎因子的分泌減少，打破這種平衡，則會(huì)引發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，所以一些能夠促進(jìn)抗炎因子分泌的藥物也成了研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠AA模型的制備及對(duì)對(duì)照組和模型組大鼠關(guān)節(jié)炎癥積分、影像學(xué)、病理學(xué)等相關(guān)指標(biāo)的評(píng)估，進(jìn)一步探討了IL-4和IL-10在AA模型中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果表明IL-4和IL-10大鼠模型中的表達(dá)受到了抑制，這與其在RA患者中的相關(guān)表達(dá)特點(diǎn)相類似。作為在RA中大量存在的T細(xì)胞來源的細(xì)胞因子IL-4和IL-10可能成為評(píng)價(jià)RA病情和治療療效的兩個(gè)最重要免疫學(xué)指標(biāo)?？傊瑢?duì)IL-4和IL-10的深入研究必將有助于對(duì)RA發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，合理地評(píng)價(jià)RA的病情進(jìn)展，為RA治療，包括藥物及免疫治療提供更加科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]劉慧招，沈敬華.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫機(jī)制的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2008，40（3）：327-329.

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