抗骨增生片對兔骨關(guān)節(jié)炎滑膜病理形態(tài)及uPA、uPAR表達(dá)的影響*

尹學(xué)永 谷寧飛 王志文 馬敬習(xí) 于 楊

1河北省秦皇島市第二醫(yī)院（河北秦皇島066600）2天津中醫(yī)藥大學(xué)（天津300193）3河北省安國市醫(yī)院（河北安國071200）4河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院（河北唐山063000）

抗骨增生片具有補(bǔ)腎、活血、止痛之功效，臨床應(yīng)用治療骨關(guān)節(jié)炎取得滿意療效。此研究通過建立兔實(shí)驗(yàn)性膝骨關(guān)節(jié)炎模型，觀察抗骨增生片對其滑膜病理組織形態(tài)及尿激酶型纖溶蛋白酶原激活物（uPA）及其受體（uPAR）表達(dá)的影響，以探討該藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎是否與減輕滑膜損害、降低二者的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥物與動(dòng)物 抗骨增生片：通化華夏藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；成分：熟地黃、鹿銜草、骨碎補(bǔ)（燙）、淫羊藿、肉蓯蓉、雞血藤、萊菔子（炒）；批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字Z22023683。雄性日本大耳白兔30只，體質(zhì)量（2.50±0.150）kg。 于室溫分籠飼養(yǎng)，按頓供給標(biāo)準(zhǔn)飼料（由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），自由活動(dòng)、飲水。

1.2 試劑與儀器 木瓜蛋白酶購自天津市諾奧科技發(fā)展有限公司，活力200萬U/g；uPA、uPAR免疫組化試劑盒均購自武漢博士德試劑公司；石蠟組織切片機(jī)，天津天利航空機(jī)電有限公司；光學(xué)顯微鏡，BX50型，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。

1.3 分組與造模 健康雄性日本大耳白兔30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組，抗骨增生片組。每組各10只。參照文獻(xiàn)[1]方法，用氯氨酮肌肉注射（10mg/kg）麻醉動(dòng)物后，模型對照組和抗骨增生片組均于右膝關(guān)節(jié)處剔毛，碘伏消毒，將關(guān)節(jié)輕彎，經(jīng)髕腱內(nèi)側(cè)進(jìn)針，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.5mL，隔3d注射1次，共注射3次。期間動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)飼料正常飼養(yǎng)。

1.4 給藥方法 造模結(jié)束后24h開始給藥。抗骨增生片組按成人每日每千克體質(zhì)量用藥量的6倍劑量作為大耳白兔的等效劑量[2]（抗骨增生片 0.36g/kg），藥物溶于 10mL 生理鹽水中灌胃，每日1次；正常對照組和模型對照組灌胃等量生理鹽水。給藥4周。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 于末次給藥后24h以氣栓法處死動(dòng)物，沿右側(cè)膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約3cm×3cm的區(qū)域，以齒鑷提起髕骨，沿髕骨上緣約0.3～0.4cm處向下切割直至髕骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨，此時(shí)即打開了右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔，可見由髕骨下緣向上延續(xù)的滑膜組織。完整剝離滑膜組織，最后以眼科鑷輕輕夾住其游離端，用刀片完整切下。標(biāo)本用新鮮配制10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。每個(gè)標(biāo)本制作3張切片，一張進(jìn)行蘇木素和伊紅染色光鏡觀察，做病理形態(tài)學(xué)分析；另兩張作免疫組化測定。以滑膜組織病理形態(tài)學(xué)積分，uPA、uPAR陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行量化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下滑膜組織形態(tài) 正常對照組：滑膜細(xì)胞單層，形態(tài)扁平，薄膜樣，半透明，無血管增生，無纖維化，無乳頭狀增生，偶見炎細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。模型對照組：滑膜組織明顯充血、水腫，表現(xiàn)為小血管增多、擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞，間質(zhì)疏松，有較多炎性細(xì)胞浸潤、纖維細(xì)胞增生，有血管翳形成，滑膜細(xì)胞增生成多層，呈乳頭狀，其下方出現(xiàn)明顯的巨噬細(xì)胞樣肉芽腫性病變?？构窃錾M：滑膜腫脹、充血程度及較模型對照組明顯減輕，滑膜細(xì)胞增生亦較模型對照組輕，未見明顯炎細(xì)胞浸潤及血管增生，巨噬細(xì)胞樣肉芽腫性病變及間質(zhì)纖維化不明顯。

2.2 滑膜病理積分 參照巫桁錁等[3]滑膜病理評分標(biāo)準(zhǔn)對各組兔關(guān)節(jié)進(jìn)行評分?？构窃錾M及模型對照組滑膜組織病理形態(tài)各單項(xiàng)積分及總積分高于正常對照組（P＜0.01），抗骨增生片組滑膜組織病理形態(tài)各單項(xiàng)積分及總積分明顯低于模型對照組（P＜0.05）。 結(jié)果見表 1 。

表1 各組滑膜病理形態(tài)單項(xiàng)積分比較 （分，±s）

表1 各組滑膜病理形態(tài)單項(xiàng)積分比較 （分，±s）

與正常對照組比較,▲P＜0.01;與模型對照組比較,△P＜0.05。下同。

組別 n 炎性細(xì)胞浸潤正常對照組 10 0.45±0.28模型對照組 10 2.35±0.63▲抗骨增生片組 10 2.30±0.48▲△纖維組織增生0.75±0.68 2.60±0.40▲2.25±0.68▲△滑膜組織增生 巨噬細(xì)胞增生 總積分0.40±0.39 0.55±0.50 2.95±1.42 2.50±0.41▲ 2.55±0.50▲ 10.40±0.77▲2.20±0.42▲△ 2.10±0.52▲△ 9.20±1.06▲△

2.2 各組uPA、uPAR陽性細(xì)胞表達(dá)比較 各組的滑膜襯里層細(xì)胞、滑膜下層單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞、多型核白細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞均出現(xiàn)uPA和uPAR的表達(dá)，在抗骨增生片組及模型對照組滑膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度高于正常對照組（P＜0.01），抗骨增生片組滑膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于模型對照組 （P＜0.05）。 結(jié)果見表2。

3 討 論

盡管骨關(guān)節(jié)炎（OA）病因復(fù)雜并存在爭議，但總伴有不同程度的滑膜炎癥。在諸多因素引起的軟骨退變過程中，滑膜的炎性介入是加速軟骨退變且誘發(fā)臨床癥狀的重要因素之一。有研究證明，膝骨關(guān)節(jié)炎可表現(xiàn)為滑膜水腫、血管擴(kuò)張，滑膜細(xì)胞分泌異常旺盛、功能活躍，關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液增多，壓力增大，使循環(huán)受阻，局部代謝產(chǎn)物堆積[4]。如此循環(huán)往復(fù)，致使滑膜逐漸增厚、纖維化、粘連，滑膜中uPA，uPAR增高，加劇滑膜炎癥，并可直接釋放入關(guān)節(jié)液中，與各種細(xì)胞因子間相互作用，使得滑膜炎癥遷延，并激活軟骨中的纖溶酶原，被激活的纖溶酶可引起關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞[5-6]，從而形成惡性循環(huán)，影響膝關(guān)節(jié)的正?；顒?dòng)，加重OA癥狀。

表2 各組uPA、uPAR陽性細(xì)胞表達(dá)比較 （±s）

表2 各組uPA、uPAR陽性細(xì)胞表達(dá)比較 （±s）

組 別 n uPA uPAR正常對照組 10 2.60±1.26 2.40±1.35▲模型對照組 10 33.30±4.22▲ 33.5±5.32▲抗骨增生片組 10 29.10±4.93▲△ 24.6±5.64▲△

OA屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”、“痛痹”等范疇，其發(fā)病與年老肝腎虧虛、外感風(fēng)寒濕邪密切相關(guān)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)氣血、痰瘀凝滯而發(fā)病，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。肝腎虧虛、瘀血阻滯是骨痹發(fā)生的病機(jī)關(guān)鍵?？构窃錾M方精煉、簡而力專。方中熟地黃、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、肉蓯蓉具補(bǔ)腎益精、填髓壯骨之效，雞血藤、鹿銜草、萊菔子具理氣活血、祛風(fēng)除濕之功，組方切合骨痹腎虛、血瘀之病機(jī)，臨床應(yīng)用能有效緩解膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛、晨僵，消除關(guān)節(jié)腫脹，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，延緩病情的進(jìn)展。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射造模后滑膜組織明顯充血、水腫，均出現(xiàn)了病理性損壞?？构窃錾o藥后滑膜充血、肥厚減輕，病理積分與模型組比較明顯下降，具有顯著差異。治療后滑膜中uPA、uPAR的陽性表達(dá)降低。

綜上分析，抗骨增生片治療OA可能與以下機(jī)制有關(guān)：通過抑制滑膜炎癥，減少滑液分泌量，從而減少滑膜細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌，減輕其對關(guān)節(jié)軟骨的破壞；該藥的有效成分與uPA上的酶結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合而降低其表達(dá)，或能夠直接抑制滑膜細(xì)胞合成分泌uPA和uPAR而使其含量下降，降低關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解；改善膝關(guān)節(jié)組織血液循環(huán)并清除炎性細(xì)胞對軟骨的損傷等因素而改善關(guān)節(jié)軟骨正常的內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)滑膜細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的修復(fù)，起到防治OA，延緩軟骨退行性改變的作用。

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