潤通舒對燙傷大鼠腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用研究*

喻正科 陳立峰 顏 旭 王銀山 李勇敏 周 兵 何亞輝

湖南省中醫(yī)藥研究院（湖南長沙410006）

機(jī)體在嚴(yán)重燙傷等應(yīng)激狀態(tài)下，腸道黏膜屏障功能削弱或損害，腸道內(nèi)的細(xì)菌、內(nèi)毒素易位進(jìn)入血液循環(huán)，并在一定條件下激發(fā)細(xì)胞因子的連鎖反應(yīng)和毒性網(wǎng)絡(luò)，引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致中毒性腸麻痹，最終可引起多器官功能障礙綜合征（MODS），甚至多器官功能衰竭（MOF）。上述一系列情況發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵之一，是腸黏膜屏障包括機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障功能損害。筆者以往的研究[1]發(fā)現(xiàn)依據(jù)滋陰活血潤腸法組方的潤通舒可減少燙傷大鼠腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，抑制腸組織細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)旨在過去研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討本方對燙傷大鼠腸道黏膜菌群的影響和提高免疫功能的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 潤通舒由生地黃、玄參、當(dāng)歸等8味藥物組成，由湖南省中醫(yī)藥研究院研制。上述藥物按 《中華人民共和國藥典》規(guī)格采購，按要求制成超微顆粒再壓成片劑，每片含生藥0.6g。取上述片劑置乳缽中研磨，用蒸餾水配制成50mg/mL質(zhì)量濃度的混懸液。

1.2 分組及造模 SD大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。根據(jù)文獻(xiàn)[2]制作模型。動物禁食（不禁水）過夜，動物腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，背部用20%硫化鈉脫毛約10cm×6cm，將背部浸入沸水中12s，造成背部8cm×4.5cmⅢ°燙傷（經(jīng)病理切片證實(shí)）。傷后1h，腹部皮下注射生理鹽水50mL/kg抗休克，創(chuàng)面涂20%磺胺嘧啶銀糊劑，單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食水。將大鼠隨機(jī)分成治療組（n=30），對照組（n=30），正常組（n=10）。 治療組給潤通舒 50mg/kg，每日分2次灌胃，對照組予生理鹽水（1mL/100g）灌胃，兩組分別在燙傷后第1日，第3日、第7日取10只麻醉，無菌操作下剖腹并行主動脈穿刺抽血處死，正常組不處理，直接處死進(jìn)行檢測。

1.3 血漿內(nèi)毒素測定 凡與鱟試劑接觸物件均須滅菌和去熱源處理。無菌條件下抽血1mL，肝素抗凝，500r/min離心5min，取血漿0.1mL，加入無熱源生理鹽水0.2mL、Tris-HCl緩沖液0.2mL混勻，置于100℃水浴加熱10min，3000r/min，取上清檢測。檢測用鱟試驗(yàn)偶氮顯色法，鱟試劑盒由RDEzymelinked Immunosorbent Assay提供。

1.4 腸黏液SIgA測定 剪取空回腸中段約20cm，再分成3～4段，縱行剖開，輕輕刮除腸腔內(nèi)糞便等，用玻片刮取腸黏液，收集于EP管中，加入0.01mol/L PBS，混勻后3000r/min離心10min，取上清，采用雙抗夾心放免法測定。嚴(yán)格按說明書操作，同時(shí)取上清用雙縮脲法測定總蛋白，由上述結(jié)果計(jì)算每毫克腸黏液蛋白中SIgA的微克數(shù)。

1.5 回盲部黏膜菌群檢測 剪取靠回盲部末端2.5cm盲腸，縱行剖開，輕輕清除內(nèi)容物，用0.01mol/L PBS漂洗3次，無菌濾紙吸干，稱質(zhì)量，10000r/min離心勻漿，10倍系列稀釋勻漿液。取100μL，分別接種于各種選擇培養(yǎng)基，需氧培養(yǎng)（37℃）24h，真菌和厭氧菌培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)并鑒定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，各項(xiàng)指標(biāo)以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿內(nèi)毒素水平的改變 見表1。與正常組比較，對照組大鼠傷后1、3d及治療組1d血漿內(nèi)毒素含量明顯增加（P＜0.05或0.01）；1d、3d時(shí)治療組血漿內(nèi)毒素含量均低于對照組 （P＜0.05），而 3、7d 時(shí)接近正常組。

2.2 小腸黏液SIgA質(zhì)量濃度變化 見表1。與正常組比較，對照組大鼠傷后小腸黏液SIgA質(zhì)量濃度持續(xù)減少 （P＜0.05或0.01），以 1、3d明顯；治療組與正常組比較傷后 1d亦減少（P＜0.05），但3、7d明顯恢復(fù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 回盲部黏膜菌群的變化 見表2。與正常組比較，對照組大鼠傷后黏膜菌群中雙歧桿菌量均明顯減少，治療組傷后1d雙歧桿菌量較正常組亦明顯降低，其后則變化較大，傷后3、7d與正常組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對照組相比較，顯著增加。與正常組相比較，對照組大鼠傷后1d、3d黏膜菌群中大腸埃希菌量均明顯增加；治療組大鼠傷后3d、7d均明顯減少，與對照組相比較，治療組大鼠傷后1d、3d、7d均顯著降低。與正常組相比較，對照組大鼠傷后黏膜菌群中真菌量均明顯增加，以傷后1d、3d最多；治療組未見真菌量增加，且明顯低于對照組。

表1 各組大鼠小腸黏液SIgA、血漿內(nèi)毒素水平比較 （±s）

表1 各組大鼠小腸黏液SIgA、血漿內(nèi)毒素水平比較 （±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n 黏液SIgA（μg/mg）內(nèi)毒素（EU/mL）0.0698±0.0476 1d 10 61.32±13.23** 0.2413±0.1476**對照組 3d 10 51.36±18.45** 0.1889±0.1563*7d 10 66.53±19.42* 0.1139±0.0913 1d 10 69.96±17.32* 0.1304±0.0819*△治療組 3d 10 73.61±12.14△ 0.0968±0.0463△7d 10 84.76±16.23△ 0.0813±0.0395正常組 10 88.13±16.81

表2 各組大鼠回盲部黏膜菌群的變化 （lgCFU/g，±s）

表2 各組大鼠回盲部黏膜菌群的變化 （lgCFU/g，±s）

組 別 n 雙歧桿菌正常組 10 7.62±0.73真菌2.13±0.81 5.62±1.13**對照組 3d 10 6.04±0.42** 5.45±1.56** 3.76±0.56**7d 10 6.16±0.54** 4.21±0.97 2.97±0.95*1d 10 6.33±0.94* 3.86±1.34△△ 2.61±0.84△△治療組 3d 10 7.45±0.63△△ 1.63±0.86**△△ 2.54±1.13△△7d 10 7.56±0.82△△ 2.34±0.95**△△ 1.96±0.75△大腸埃希菌4.13±0.82 1d 10 6.11±0.83** 3.65±0.75**

3 討 論

燙傷后，由于創(chuàng)傷而處于應(yīng)激狀態(tài)，往往破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受到損害，其通透性升高，從而使腸道蓄積的內(nèi)毒素得以侵入體內(nèi)，形成內(nèi)毒素血癥[3]。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大鼠傷后1、3d對照組血漿內(nèi)毒素明顯高于正常組，潤通舒灌胃后，大鼠傷后1d血漿內(nèi)毒素含量即明顯降低，3、7d接近于正常組，提示本方可明顯降低內(nèi)毒素的入侵。

腸道局部免疫功能在燙傷時(shí)腸源性感染的發(fā)生中起重要的保護(hù)作用，腸黏膜表面黏液層具有重要的生理屏障功能。黏液中的糖蛋白和SIgA相互配合，將SIgA包繞的細(xì)菌牢固地限于黏液層中，并隨黏液層的更新和流動將包繞的有害菌排除體外[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嚴(yán)重燙傷后，腸黏液SIgA分泌明顯受抑，而傷后大鼠予潤通舒灌胃后3、7d SIgA質(zhì)量濃度接近于正常水平，提示該方可增加腸道SIgA的合成與分泌，從而改善腸道局部免疫功能。

正常情況下，腸道菌群通過與腸黏膜附著結(jié)合形成生物屏障，一方面與宿主保持共生關(guān)系，提供營養(yǎng)成分或參與免疫系統(tǒng)的構(gòu)建；另一方面，使機(jī)體免受潛在致病菌的侵襲。在某些情況下，如嚴(yán)重?zé)齽?chuàng)傷、大手術(shù)等，腸道生物屏障遭到破壞，腸內(nèi)菌群紊亂，導(dǎo)致細(xì)菌或內(nèi)毒素移位，進(jìn)一步加重病情[5]。腸道生物屏障99%由厭氧菌組成，而雙歧桿菌所占比例最大，在維護(hù)腸道生物屏障方面居主導(dǎo)地位。它既可有效抑制G-腸桿菌等優(yōu)勢移位菌的過度增殖，又能夠刺激腸道局部免疫功能，使SIgA合成和分泌增加，從而發(fā)揮其保護(hù)生物屏障的作用。本實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到燙傷后回盲部黏膜菌群改變顯著，表現(xiàn)為雙歧桿菌量明顯減少，大腸埃希菌和真菌量成倍增加。但傷后予潤通舒灌胃，在短時(shí)間內(nèi)雙歧桿菌量即明顯增加，大腸埃希菌和真菌量顯著減少，表明該方可改善腸道菌群的平衡失調(diào)。

機(jī)體在遭受嚴(yán)重創(chuàng)傷、燙傷時(shí)損血失津，致陰虧津少，則血行澀滯，血脈瘀阻，反過來又影響津血之化生，如此則腸失濡潤，從而導(dǎo)致腸道傳輸失司，大便燥結(jié)，糟粕內(nèi)停，糞毒滯留，熱隨毒生，反過來進(jìn)一步損血耗津，內(nèi)傷臟腑，甚至導(dǎo)致臟腑功能衰竭。潤通舒依據(jù)中醫(yī)“六腑以通為用”的理論，提出了滋陰活血潤腸治則，滋陰以助津液，津液輸布，腸道得以濡潤，傳導(dǎo)功能才得以恢復(fù)；活血以改善腸道微循環(huán)，降低血管阻力，緩解腸黏膜缺血、缺氧程度；潤腸以防治腸麻痹，保證腸道能及時(shí)有效地排除濁質(zhì)或濁氣，做到治本清源的目的。

[1]鄭愛華，蔡光先，王銀山，等.滋陰活血潤腸法對燙傷大鼠腸黏膜屏障的影響[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2008，8（1）：2.

[2]王忠堂，姚詠明，肖光夏，等.雙歧桿菌對燙傷大鼠腸道黏膜機(jī)械及生物屏障的改善作用[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2003，15（3）：155.

[3]張雅萍，王忠堂.B.B.R對嚴(yán)重?zé)齻笫竽c道屏障功能的保護(hù)作用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2002，14（5）：250.

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[5]王忠堂，肖光夏，肖杰，等.雙歧桿菌懸液對嚴(yán)重?zé)齻颊呙懒_培南用后腸菌群紊亂的扶正作用 [J].中華燒傷雜志，2002，18（3）：111-112.