枸杞子水提物提取工藝優(yōu)化及其對(duì)酪氨酸酶活性影響

劉 戀，黎 莉，方繼德，呂 萌

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430074)

0 引 言

枸杞為茄科Solanaceae枸杞屬落葉灌木植物,是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用的名貴中藥材,主要分布于我國(guó)西北地區(qū)，其中以寧夏枸杞的應(yīng)用最為廣泛.明朝李時(shí)珍在《本草綱目》中記載枸杞具有久服堅(jiān)筋骨，補(bǔ)精氣諸不足，明目安神，令人長(zhǎng)壽等功效[1].現(xiàn)代科學(xué)研究表明,枸杞的藥用和生物活性與其所含的多糖有很大關(guān)系，它具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抑制腫瘤、降血脂、降血糖、抗氧化和抗衰老等多方面的作用[2].

酪氨酸酶是皮膚黑色素生成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它具有催化酪氨酸并進(jìn)一步氧化生成黑色素的作用.因此，可以應(yīng)用酪氨酸酶抑制劑來(lái)抑制酪氨酸酶的活性，從而阻斷黑色素的合成反應(yīng)鏈[3].而寧夏枸杞水提物顯著的抗氧化活性已得到相關(guān)的研究證明[4].另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枸杞子水提物的抗氧化活性高于其經(jīng)過(guò)純化的多糖，這是因?yàn)殍坭阶哟痔嵛镏泻蓄?lèi)胡蘿卜素、核黃素、抗壞血酸、硫氨素和煙酸等，這些物質(zhì)可能也參與了抗氧化反應(yīng)[5]；并且在相關(guān)文獻(xiàn)中，還未見(jiàn)枸杞子影響酪氨酸酶活性的報(bào)道.因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)枸杞子采用水提法進(jìn)行提取[6]，并運(yùn)用酪氨酸酶氧化法測(cè)定枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn)；AB204-N型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司生產(chǎn)；TD5-2臺(tái)式低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司生產(chǎn)；DZ-1BC型真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn).枸杞子購(gòu)于寧夏銀川市，經(jīng)中南民族大學(xué)萬(wàn)定榮教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥成熟果實(shí)；無(wú)水葡萄糖(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，T20090515)；熊果苷分析標(biāo)準(zhǔn)品(上海晶純?cè)噭┯邢薰旧a(chǎn)，35648)；其它試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 枸杞子水提物的提取工藝研究a.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì).參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，選取料液比A，提取時(shí)間B，提取次數(shù)C作為三個(gè)考察因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以提取所得的枸杞多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo).因素水平表見(jiàn)表1.b.提取工藝.按表1排定的1號(hào)實(shí)驗(yàn)為例，稱(chēng)取一定量于50 ℃烘干的枸杞子，加10倍量蒸餾水，回流提取1次，每次提取時(shí)間為15 min.其余樣品按正交表設(shè)定的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

表1 因素水平表

1.2.2 枸杞子水提物多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定a.對(duì)照品溶液的配制.精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.025 0 g于250 mL容量瓶中，加水溶解并定容，充分混勻.葡萄糖對(duì)照品溶液的濃度為0.1 mg/mL.b.顯色劑的配制.稱(chēng)取蒽酮0.2 g置于棕色瓶中，再加入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95％的濃硫酸，充分溶解后待用.c.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制.精密吸取5、10、15、20、25 mL葡萄糖對(duì)照品溶液0于5個(gè)50 mL容量瓶中，加水定容，分別配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液.取5種不同濃度的葡萄糖對(duì)照品溶液各2 mL分別置于5支試管中，標(biāo)號(hào)為1、2、3、4、5.再往5支試管中均加入4 mL顯色劑，于100 ℃沸水浴中放置10 min，接著迅速放入冰水浴中冷卻，然后室溫放置8 min.以2 mL水加4 mL顯色劑作為空白對(duì)照，在625 nm處測(cè)定吸光度[8].以濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為A=55.961C-0.099 8R2=0.999 4.結(jié)果表明多糖濃度在0.003 3～0.016 7 mg/mL之間與吸光度有較好的線(xiàn)性關(guān)系.d.樣品含量測(cè)定.將制備的枸杞子水提液經(jīng)室溫冷卻后，于4 000 r/min離心10 min，然后用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾.精密吸取樣品溶液1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水定容.再按照“1.2.2”項(xiàng)c中的方法操作，測(cè)得的吸光度代入回歸方程中計(jì)算樣品的多糖含量.

1.2.3 酪氨酸酶活性影響的測(cè)定a.溶液的配制.緩沖液：用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制成pH6.8的磷酸鹽緩沖液；底物溶液：用L-酪氨酸配成濃度為0.1 mg/mL的溶液.酶溶液：稱(chēng)取適量酪氨酸酶溶于緩沖液中.b.酶活力測(cè)定.空白：取L-酪氨酸溶液0.35 mL，加入緩沖液0.4 mL，再加入純凈水0.75 mL；樣品：取L-酪氨酸溶液0.35 mL，加入磷酸鹽緩沖液0.4 mL，再加入純凈水0.25 mL.將空白和樣品均放入30 ℃水浴鍋中，保溫10 min后取出，再往樣品中加入酪氨酸酶溶液0.5 mL，迅速用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其在317 nm處的吸光度變化，并連續(xù)記錄3 min，得酶促反應(yīng)曲線(xiàn).c.抑制率測(cè)定.將在最佳工藝條件下制備的樣品溶液于50 ℃真空干燥.精密稱(chēng)取一定量的干燥樣品，分別置于6個(gè)容量瓶中，加水定容，配成濃度為0.08、0.26、0.79、1.12、2.24、5.08 mg/mL的6種不同質(zhì)量濃度的樣品溶液.按照“1.2.3”項(xiàng)b中的方法，分別測(cè)定這6份樣品溶液對(duì)酪氨酸酶的抑制率.以不加樣品液為空白對(duì)照，并以熊果苷分析標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定酶相對(duì)的剩余活力.枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率計(jì)算公式為：抑制率(％)=(A0-AI)/A0×100％，A0為無(wú)抑制劑時(shí)的酶活力，AI為有抑制劑時(shí)的酶活力.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.從表2得出最佳提取工藝條件為A2B2C3.即在料液比為1∶20，提取時(shí)間為30 min，提取次數(shù)為3次的條件下，提取的多糖含量較高.由表2中的極差大小得知影響提取效果的主次因素順序?yàn)椋篈>C>B，即料液比的影響最顯著，其次為提取次數(shù)，最后為提取時(shí)間.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 酪氨酸酶的酶促反應(yīng)時(shí)間曲線(xiàn)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在波長(zhǎng)317 nm處測(cè)定酪氨酸酶活力靈敏度較高[9].由圖1可看出，0～1 min吸光度變化較明顯，曲線(xiàn)上升幅度較大，之后2 min吸光度變化較小，曲線(xiàn)上升趨勢(shì)減緩.

圖1 吸光度與時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn)

2.3 枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響見(jiàn)圖2，枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶具有明顯的抑制作用，并對(duì)酪氨酸酶的抑制效率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng).由曲線(xiàn)所得的回歸方程為：Y=-19.482ln(x)+43.890；R2=0.992 4.通過(guò)回歸方程計(jì)算得出：枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶抑制率為50％時(shí)的質(zhì)量濃度為0.73 mg/mL.同樣方法測(cè)定熊果苷的IC50為0.28 mg/mL.

圖2 抑制率與樣品濃度的關(guān)系曲線(xiàn)

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)枸杞的提取純化、組分分離以及生物活性等方面進(jìn)行了深入的研究，為枸杞多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)[10].然而迄今為止，枸杞仍主要是作為食用保健品被廣泛應(yīng)用.因此，如何根據(jù)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，并結(jié)合中醫(yī)藥理論知識(shí)，對(duì)枸杞其它方面的藥理作用進(jìn)行更加深入地研究，如用于研究色素沉著性皮膚病的治療，還有待進(jìn)一步地探討.本實(shí)驗(yàn)已證明枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶催化酪氨酸形成多巴的過(guò)程具有明顯的抑制作用，這將為枸杞子水提物作為一種新型酪氨酸酶抑制劑提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

參考文獻(xiàn)：

[1]李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1975:1452-1455.

[2]王金章,王秀娟.枸杞子的化學(xué)成分和藥理研究概況[J].天津藥學(xué),1999,11(3):14-16.

[3]丁大鵬,馬文麗,鄭文嶺.酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2005,21(12):1364-1365.

[4]Wu S J,Ng L T,Lin C C.Antioxidant activities of some common ingredients of traditional chinese medicine,Angelica sinensis,Lycium barbarum and Poria cocos[J].Phytother Res,2004,18(12):1008-1012.

[5]Luo Qiong,Cai Yi Zhong,Yan Jun,et al.Hypoglycemic and hypolipidemic effects and antioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum[J].Life Sciences,2004,76(2):137-149.

[6]Cai Yi Zhong,Luo Qiong,Sun Mei,et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J].Life Sciences,2004,74(6):2157-2184.

[7]邱敏芳，黎莉，方繼德,等.番石榴多糖提取工藝的優(yōu)化[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(1):22-24.

[8]易劍平,畢雅靜,宋秀榮,等.蒽酮一硫酸法測(cè)定構(gòu)祀多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究[J].北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,31(6):641-646.

[9]蔣萌蒙,田呈瑞,王向軍.雙孢蘑菇中酪氨酸酶的特性[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,24(2):194-198.

[10]魏永祥,商希禮.枸杞多糖的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(11):5834-5836.