無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲作用方式的研究

白春明, 段玉璽*, 陳立杰, 劉軼飛, 于曉飛

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院北方線蟲研究所,沈陽 110866; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,沈陽 110866)

南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)是一種典型的土傳病害,也是當(dāng)今防治困難的世界性難題。該病害已經(jīng)蔓延至全球,每年僅對世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物造成的損失就高達(dá)數(shù)百億美元[1]。線蟲長期存活在土壤中,土中的化學(xué)物質(zhì)及多種植物所需的營養(yǎng)(無機(jī)化合物)對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲(J2)的作用尚不清楚。目前有關(guān)秀麗小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)環(huán)境脅迫尤其是重金屬毒性作用的研究比較多[2-3],因為秀麗小桿線蟲易于在實(shí)驗室培養(yǎng),繁殖速度快而可大量獲得,從受精卵發(fā)育到成蟲僅需不到4 d時間,試驗周期短,已經(jīng)成功應(yīng)用于土壤與環(huán)境中毒物毒性評估與毒理學(xué)研究[4]。而南方根結(jié)線蟲試驗周期長,獲得大量蟲源比較困難,有關(guān)無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲的致死作用及作用機(jī)理的研究少之又少。我們在前期工作中篩選出南方根結(jié)線蟲敏感的化合物 NH4HCO3、CuSO4?5H2O和FeCl3?6H2O,這些化合物在低濃度下就可使J2致死。其中硫酸銅是眾所周知的殺菌劑,碳酸氫銨可作為基肥或追肥,且有報道稱有望成為殺線劑[5]。因此,我們進(jìn)一步研究了敏感化合物溶液在離體條件下對南方根結(jié)線蟲J2的致死作用,對其運(yùn)動行為、個體發(fā)育的影響及在脅迫處理下對J2呼吸作用和體液滲漏的影響,初步了解3種無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2的作用方式。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

根結(jié)線蟲采自遼寧省沈陽市東陵區(qū)渾河站鄉(xiāng)前賽村日光溫室內(nèi)黃瓜上。單卵囊用0.4%NaClO消毒后接種番茄感病品種‘L402'(接種土經(jīng)180℃干熱滅菌,‘L402'由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈)上進(jìn)行擴(kuò)繁,培養(yǎng)溫度為25～28℃,接種30～45 d后,番茄根系上有大量卵囊出現(xiàn),取出根系,用水輕輕沖洗,獲得雌蟲和2齡幼蟲(J2),經(jīng)嚴(yán)格鑒定為南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)。待擴(kuò)繁2代后,從感病番茄根系上挑取新鮮卵囊,用0.4%NaClO消毒3 min,再用無菌水沖洗3次,置于培養(yǎng)皿中,于25℃恒溫箱中培養(yǎng),每隔24 h換水1次,保證每次選用的J2新鮮、活力一致。

1.2 供試化合物

經(jīng)前期試驗確定南方根結(jié)線蟲最為敏感的無機(jī)化合物為 NH4HCO3、CuSO4? 5H2O、FeCl3?6H2O[6],試驗均采用分析純試劑。

1.3 無機(jī)化合物不同時間處理對南方根結(jié)線蟲J2存活及致死時間的影響

在體式顯微鏡下挑取新鮮活躍的南方根結(jié)線蟲J230條,放入1.5 mL離心管中,內(nèi)有配制好的無機(jī)化合物 NH4HCO3、CuSO4?5H2O、FeCl3?6H2O LC50和LC90的溶液,分別為0.03 mol/L和0.04 mol/L、0.000 4 mol/L和0.000 5 mol/L、0.000 7 mol/L和0.001 1 mol/L,每管溶液體積為1 mL。分別處理0.5、1、3、6、12 h和 24 h 后在體式解剖鏡下觀察,記錄存活數(shù)量。無菌水處理為對照,每處理重復(fù)3次。

線蟲校正死亡率=[(處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率)/(1-對照組線蟲死亡率)]×100%。結(jié)果應(yīng)用Excel 2003和SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析,并計算各化合物 LC50和LC90濃度下J250%死亡時間和90%死亡時間。半數(shù)致死時間定義為死亡線蟲數(shù)占測試線蟲總數(shù)一半時的時間;90%死亡時間定義為死亡線蟲數(shù)占測試線蟲總數(shù)90%時的時間。

1.4 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2運(yùn)動行為的影響

運(yùn)動行為的測定主要參照T salik和Hobert的方法[7]。

將新鮮活躍的南方根結(jié)線蟲J2放入濃度分別為LC50和LC90的NH4HCO3、CuSO4?5H2O和FeCl3?6H2O溶液中,每1 mL藥液放入30條J2,分別處理0.5、1、3、6、12 h 和 24 h,在體式解剖鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)J2身體彎曲的次數(shù)。身體彎曲頻率：1次彎曲定義為線蟲相對于身體長軸方向上的1個波長的移動。同樣方法記錄1 min內(nèi)頭部擺動次數(shù)和J2運(yùn)動的次數(shù)。頭部擺動頻率：J2頭部從一側(cè)擺向另一側(cè)后,再擺動回來?；具\(yùn)動能力：J2在1 min內(nèi)向前、向后和向前運(yùn)動時,方向上出現(xiàn)小于120°的轉(zhuǎn)角運(yùn)動的次數(shù)。無菌水處理為對照,每處理記錄10條J2運(yùn)動行為,試驗重復(fù)3次。

1.5 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2個體發(fā)育的影響

用無機(jī)化合物NH4HCO3、CuSO4?5H2O和FeCl3?6H2O處理J2后測量其體長、口針長度和透明尾長度的變化。體長指沿線蟲體軸縱向的長度。將新鮮活躍的南方根結(jié)線蟲J230條放入濃度分別為 LC50和 LC90的體積為 1 mL溶液中,分別處理3、6、12 h和24 h后,挑取J2放在載玻片上用Motic數(shù)碼生物顯微鏡照相系統(tǒng)觀察、攝像并保存圖片,測量體長,無菌水處理為對照,每處理記錄10條J2的數(shù)據(jù),試驗重復(fù) 3次?？卺橀L度和透明尾長用NH4HCO3、CuSO4?5H2O 處理 24 h后測量(活躍的J2不宜攝像且脂肪粒多看不清口針長度及透明尾長)。

1.6 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2呼吸作用和體液滲漏的影響

無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2的呼吸作用采用溶氧儀測定法,對其體液滲漏的影響采用電導(dǎo)率測定法。配制線蟲懸浮液,J2濃度為2×104條/mL,分別用 NH4HCO3、CuSO4?5H2O 和 FeCl3?6H2O 的 LC50濃度處理 J20.5、1、3、6、12 h 和 24 h,用溶解氧測定儀(JPSJ-605)測定各處理線蟲的呼吸強(qiáng)度,計算藥劑對J2呼吸的抑制作用。用電導(dǎo)率儀(DDSJ-308A)測定各處理J2懸浮液的電導(dǎo)率。以純水及藥劑原溶液為對照。每次處理重復(fù)3次。試驗在25℃水浴中進(jìn)行。

線蟲實(shí)際吸氧量(mg/L)=相應(yīng)對照原溶液溶解氧-線蟲懸浮液溶解氧;

線蟲懸浮液實(shí)際電導(dǎo)率(μ s/cm)=線蟲懸浮液電導(dǎo)率-相應(yīng)對照溶液電導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 無機(jī)化合物不同時間處理對南方根結(jié)線蟲J2存活及致死時間的影響

試驗結(jié)果表明,南方根結(jié)線蟲J2隨著處理時間的增加和濃度的升高致死率上升(圖1)。所有化合物處理6 h后J2死亡率急劇上升,其中CuSO4?5H2O對J2的致死效果比其他化合物高。以CuSO4?5H2O LC50濃度處理 24 h后致死率達(dá) 71.11%,LC90濃度處理24 h致死率高達(dá)96.67%。在LC90濃度下3種化合物50%致死時間不超過10.14 h、90%致死時間不超過22.66 h。南方根結(jié)線蟲J2對3種化合物敏感性依次為：CuSO4?5H2O＞NH4HCO3＞FeCl3?6H2O(表1)。

圖1 無機(jī)化合物脅迫對南方根結(jié)線蟲J2存活的影響

表1 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2致死時間的影響1)

2.2 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2運(yùn)動行為的影響

試驗結(jié)果表明,3種無機(jī)化合物均隨著時間加長顯著減少了南方根結(jié)線蟲J2的運(yùn)動行為,表現(xiàn)為J2身體彎曲頻率、頭部擺動頻率和運(yùn)動頻率降低。所有藥劑處理均降低了J2身體彎曲頻率。3種化合物不同濃度處理6 h前無明顯規(guī)律,6 h后LC90濃度比LC50處理對J2身體彎曲頻率的抑制作用強(qiáng)。當(dāng) NH4HCO3和 CuSO4?5H2O分別以LC90濃度處理1 h時,J2身體彎曲頻率比對照顯著升高,之后開始迅速降低。除了FeCl3?6H2O外,NH4HCO3和CuSO4?5H2O在 LC90濃度下處理12 h以上時J2基本無身體彎曲的能力(圖2上)。硫酸銅LC90處理1 h時J2突然加快了頭部擺動頻率,隨后迅速降低。其他基本與身體彎曲頻率結(jié)果相似(圖2中)。對于運(yùn)動能力的影響,NH4HCO3和CuSO4?5H2O分別處理1 h時LC90比 LC50運(yùn)動能力提高,但沒有對照高?；衔锩{迫后,J2運(yùn)動能力比身體彎曲頻率和頭部擺動頻率受到的影響程度高,尤其是CuSO4?5H2O處理24 h時運(yùn)動能力為零(圖2下)。

2.3 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2個體發(fā)育的影響

南方根結(jié)線蟲J2的體長為346～ 463 μ m,口針長度 10～ 12 μ m,透明尾長度 6～ 13.5 μ m。本試驗結(jié)果表明,所有處理無論時間長短還是濃度高低J2體長與對照相比顯著(p＜0.05)縮短,同一種化合物高濃度比低濃度處理后體長短。CuSO4?5H2O在LC90除了3 h處理外均比其他化合物處理J2體長短(圖3)?；衔锩{迫下口針長度與對照相比顯著變長,并且超出了正常口針長度范圍。NH4HCO3和CuSO4?5H2O在2種濃度處理下J2口針長度變化不同。NH4HCO3高濃度處理比低濃度處理下J2口針長,而CuSO4?5H2O高濃度下比低濃度短。同樣,化合物脅迫下透明尾長度比對照顯著變長,但仍在正常透明尾長度范圍內(nèi),且同一種化合物高濃度處理比低濃度處理透明尾長度變長(表 2)。

表2 無機(jī)化合物處理南方根結(jié)線蟲J2 24 h后口針和透明尾長度變化1)

2.4 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2呼吸作用和體液滲漏的影響

無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2呼吸有強(qiáng)烈的抑制作用。從圖4可以看出,3種無機(jī)化合物處理下線蟲的吸氧量比對照溶液中低,說明脅迫下南方根結(jié)線蟲J2吸氧率低,呼吸作用受到了抑制。當(dāng)處理12 h以上呼吸作用停止。

圖4 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2呼吸作用的影響

無機(jī)化合物處理南方根結(jié)線蟲J2后,線蟲懸浮液的電導(dǎo)率均比對照增加。從圖5可以看出3種化合物處理線蟲液的電導(dǎo)率變化有所不同。

圖5 無機(jī)化合物對南方根結(jié)線蟲J2體液滲漏的影響

硫酸銅和氯化鐵脅迫0.5～3 h后線蟲懸浮液的電導(dǎo)率急劇上升,而后趨于平穩(wěn),電導(dǎo)率幾乎不變。而碳酸氫銨脅迫3 h后線蟲懸浮液電導(dǎo)率也處于上升趨勢,直至處理24 h,但比前兩個化合物脅迫下線蟲的電導(dǎo)率低。其中硫酸銅處理12 h以上,懸浮液的電導(dǎo)率最高為45.80 μ s/cm,比對照線蟲懸浮液的電導(dǎo)率增加了24.87%。

3 討論

2齡幼蟲是南方根結(jié)線蟲侵染寄主根系的唯一蟲態(tài)。因此,影響J2存活及活動能力的藥劑都能抑制其對植物根部的侵染,減少南方根結(jié)線蟲對植物根系的危害。本試驗中3種供試化合物在LC90濃度下使J250%致死時間不超過10.14 h,90%致死時間不超過22.66 h,離體條件下均對南方根結(jié)線蟲J2存活有強(qiáng)烈的抑制作用,并且可顯著降低南方根結(jié)線蟲J2的運(yùn)動行為,導(dǎo)致J2身體彎曲頻率、頭部擺動頻率和運(yùn)動能力降低、體長縮短、透明尾變長。對毒性機(jī)理研究的模式線蟲秀麗小桿線蟲報道較多。郝偉等[8]研究表明,重金屬鉛、鎘顯著降低矮小擬麗突線蟲(Acrobeloides nanus)平均體長,并抑制其生長發(fā)育及繁殖。王大勇等[2,9-11]研究表明,銅、鋇、鋁、鉻暴露可使秀麗小桿線蟲體長變短,運(yùn)動行為發(fā)生嚴(yán)重缺陷,且這種表型與行為缺陷很大程度上可以從暴露當(dāng)代傳遞到后代個體中。這些與作者的試驗結(jié)果相似,本試驗結(jié)果中透明尾變長可能是內(nèi)含物的外滲透明區(qū)更加明顯導(dǎo)致。這些變化能否傳遞到后代需進(jìn)一步研究。

線蟲是需氧生物,氧氣的含量不僅影響線蟲的存活,也影響線蟲的孵化。缺氧可以降低土壤中線蟲的數(shù)量,Stolzy等1960年研究表明,氧氣分壓為0時,南方根結(jié)線蟲的種群數(shù)量顯著減少[12]。大多數(shù)植物寄生線蟲體重為1～2 μ g,單個蟲體消耗氧氣為10-3μ L/h,這一數(shù)值很小,因此對于線蟲呼吸的研究比較困難,有關(guān)這方面的報道也非常少見。祁之秋等[13]研究表明二硫氰基甲烷對根結(jié)線蟲呼吸有抑制作用,藥劑處理的線蟲懸浮液電導(dǎo)率明顯高于對照,與本研究結(jié)果相似。線蟲的呼吸受到抑制且處理12 h以上時呼吸率為0,這可能是隨著線蟲死亡率的升高線蟲呼吸率極低,而溶解氧測定儀精確度不高,無法測出接近0的數(shù)據(jù)。線蟲體壁由表皮層和下皮層組成,是線蟲抵御外界不良環(huán)境條件和感受蟲體內(nèi)部微細(xì)化學(xué)變化的重要結(jié)構(gòu)。藥劑是作用于線蟲體壁,使內(nèi)容物外泄導(dǎo)致電導(dǎo)率升高致線蟲死亡,還是通過口針或口腔進(jìn)入腸道破壞了線蟲腸道結(jié)構(gòu),引起體液外滲導(dǎo)致線蟲死亡,有待進(jìn)一步研究。

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