青藤堿精制工藝的優(yōu)化

臧玲玲，李永吉，孫 凌，郭玉巖，管慶霞，楊志欣，侯 佳

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

青風(fēng)藤為防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤莖，臨床常用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及心率失常等［1－2］.藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為青藤堿，青藤堿的有效提取，直接影響青風(fēng)藤的藥效發(fā)揮，因此，本文通過對不同的提取純化方法的比較，優(yōu)選出青風(fēng)藤的最佳精制工藝，為工藝放大生產(chǎn)提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下.

1 試藥與儀器

青風(fēng)藤藥材(購自哈爾濱藥材市場).青藤堿對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號0775—200105).甲醇(色譜純，DIKMA TECHNOLOG INC)，實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純.

Waters高效液相色譜儀，含有在線脫氣、高壓四元梯度泵、恒溫自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD)、Empower色譜工作站(美國);分析天平(Sartorius CP225D);酸度計(梅特勒－托利多DELTA 320).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 青風(fēng)藤藥材的提取方法

取400 g青風(fēng)藤藥材，用8倍量的70%乙醇，連續(xù)回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過，濾液濃縮至250mL，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得.

2.2 青風(fēng)藤藥材精制方法優(yōu)選

1)方法 1［3］:精密量取 30mL 藥液蒸干，用2%鹽酸25mL溶解，濾過，濾液加氨試液調(diào)pH值至10，用氯仿萃取2次，每次20mL，合并氯仿層，氯仿液蒸干，得青藤堿精提物.2)方法2:精密量取30mL藥液蒸干，用2%鹽酸25mL溶解，濾過，濾液加氨試液調(diào)pH值至10，用氯仿萃取2次，每次20mL，合并氯仿層;取氯仿萃取液，加2%鹽酸水溶液萃取2次，每次40mL，收集鹽酸水溶液層，加氨試液調(diào)pH值至10后，再加氯仿萃取2次，每次80mL，收集氯仿液，蒸干，得青藤堿精提物.3)方法3:精密量取30mL藥液蒸干，用2%鹽酸25mL溶解，濾過，濾液加氨試液調(diào)pH值至10，用氯仿萃取2次，每次20mL，合并氯仿層;取氯仿萃取液，加2%鹽酸水溶液萃取2次，每次40mL，收集鹽酸水溶液層，加氨試液調(diào)pH值至10后，再加氯仿萃取2次，每次80mL，收集氯仿液，再加2%鹽酸水溶液萃取2次，每次160mL，收集鹽酸水溶液層，加氨試液調(diào)pH值至10后，再加氯仿萃取2次，每次320mL，收集氯仿液，蒸干，得青藤堿精提物.

3 質(zhì)量濃度測定

3.1 色譜條件

DIKMA Diamonsil ODS C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm);流動相為磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液加1‰三乙胺，用磷酸調(diào)pH值至3.0)∶甲醇(80∶20);流速為 1.0mL/min;檢測波長265 nm;柱溫25℃:進(jìn)樣量10μL.理論塔板數(shù)按青藤堿計算應(yīng)不低于2000.

3.2 對照品溶液制備

取干燥至恒重的青藤堿對照品2.82mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得.

3.3 供試品溶液制備

精密吸取上述“2.2”項下的各方法精制樣品適量.甲醇溶解，定容至1000mL量瓶中，濾過，進(jìn)樣.

3.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取已制備好的對照品和“2.2.3”項下的樣品，照“3.1”項下色譜條件，各進(jìn)樣 10μL，色譜圖見圖1.結(jié)果表明，樣品與對照品溶液均在相同保留時間內(nèi)出現(xiàn)青藤堿吸收峰，說明本試驗(yàn)條件下青藤堿峰與其他組分峰分離完全.

圖1 青藤堿HPLC圖譜

3.5 線性關(guān)系考察

取青藤堿對照品精密稱定為4.46mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度作為儲備液(質(zhì)量濃度為 0.446mg/mL).精密吸取 1、2、7、8mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為 0.0446、0.0892、0.3122、0.3568mg/mL 的對照品溶液及質(zhì)量濃度為0.446mg/mL的儲備液，分別進(jìn)樣10μL，測定峰面積，以對照品質(zhì)量濃度(C)對峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:Y=9E+06X+102803(R=0.9999).結(jié)果表明，青藤堿在0.0446～0.446mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好.

3.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液5份，按“3.2”項下條件測定，計算質(zhì)量濃度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.結(jié)果RSD=1.25%(n=5)，表明測定精密度良好.

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取按方法3項下條件制備溶液，分別放置 2、4、8、10、12 h，測定其峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.結(jié)果RSD=0.58%，表明樣品在放置12 h內(nèi)穩(wěn)定.

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取對照品10.34mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解，作為儲備液.精密移取儲備液各1mL，分別置9個25mL量瓶中，分別稱取按方法3制備下樣品加甲醇溶解，定容至刻度，使體積分?jǐn)?shù)成測定體積比的80%、100%、120%，各3份.進(jìn)樣測定，計算測得量及回收率，平均回收率為99.5%，RSD為0.45%.

3.9 青藤堿的百分含量和轉(zhuǎn)移率的結(jié)果

分別稱取青風(fēng)藤藥材，各5 g，按“2”項下方法平行制成供試品溶液各2份，測定樣品中青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率.結(jié)果見表1.

表1 青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率的結(jié)果

4 討論

本文參考相關(guān)文獻(xiàn)［3］，單純用氯仿萃取(方法1)，得到結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù) 35.38%，轉(zhuǎn)移率11.32%，得到青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率均較低，效果不佳;為了提高青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率，筆者在原有工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，選用在氯仿萃取基礎(chǔ)上，增加鹽酸水溶液的萃取(方法2)，得到結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)76.05% ，轉(zhuǎn)移率67.19%，結(jié)果有明顯改善，但仍不能達(dá)到較純精制;繼續(xù)增加氯仿、鹽酸水溶液的交替萃取(方法3)，得到結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.36%，轉(zhuǎn)移率79.78%，青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率都有了較大的提高.結(jié)果表明，隨著氯仿、鹽酸水溶液交替萃取次數(shù)的增加，青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸上升，轉(zhuǎn)移率有所提高，因此，選用方法3為最佳的青藤堿精制工藝，該方法可行、可靠、可控，為青風(fēng)藤及相關(guān)制劑的精制提供依據(jù)，為制藥新工藝的推廣和應(yīng)用提供了科學(xué)方法.

采用高效液相色譜法建立了青風(fēng)藤中青藤堿含量的測定方法，通過對方法的精密度、線性關(guān)系、回收率、穩(wěn)定性等考察，驗(yàn)證本法精密、準(zhǔn)確，為青藤堿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了參考依據(jù).

［1］劉 強(qiáng)，周莉玲，李 銳.青藤堿的研究概況［J］.中草藥，1997，28(4):247.

［2］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(Ⅰ部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:135.

［3］劉超英，喬 明，范衛(wèi)峰.青風(fēng)藤中青藤堿的提取分離方法比較研究［J］.湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，7(1):49－50.