趙建寶 陳 琛
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,迄今仍為不可治愈性疾病,高發(fā)于老年人。美國癌癥協(xié)會2009年統(tǒng)計顯示,MM中位發(fā)病年齡男性62歲,女性61歲。血管新生與MM發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),而調(diào)控血管新生的眾多細胞因子中環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)即為其中之一[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通過刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移,促進血管新生,其已成為多發(fā)性骨髓瘤治療的新靶點[2]。在多發(fā)性骨髓瘤中,COX-2與VEGF間的相關(guān)性研究尚少。本實驗以多發(fā)性骨髓瘤患者為研究對象,研究COX-2與VEGF表達的相關(guān)性及臨床意義;并應(yīng)用選擇性COX-2抑制劑塞來昔布干預(yù)多發(fā)性骨髓瘤U266細胞COX-2的活性,初步探討COX-2對VEGF表達的調(diào)控作用?,F(xiàn)報告如下。
1.1.1 對象 43例MM患者來自于2005年5月~2009年8月我院血液科門診及住院患者。所有患者均經(jīng)臨床、骨髓像、血免疫球蛋白(Ig)水平、骨骼X線檢查確診,診斷符合張之南《血液病診斷及療效標準》(第3版)中MM診斷標準。采用國際分期系統(tǒng)(ISS)分期標準,其中Ⅰ期12例,Ⅱ期患者14例,Ⅲ期患者17例,年齡:59(46~78)歲;β2-MG:3.13(1.23~4.98) mg/l;Ca: 2.66 (2.13~3.25)mmol/l;BMPC%:77 (29~91)%。以同期11例門診及住院的非血液腫瘤患者骨髓為對照,中位年齡58 (44~76)歲。多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266及人乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/Adr(用于陽性對照)購自中科院上海細胞庫。
1.1.2 試劑 Trizol Reagent及Neuclear/cytosol Fractionation Kit購自Invitrogen公司;PCR相關(guān)試劑購自Promage公司;人淋巴細胞分離液購自上海博蘊生物科技有限公司;噻唑蘭(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司;兔抗人COX-2多克隆抗體、兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購自博士德公司;HRP標記的山羊抗兔IgG購于美國Santa Cruz公司;ECL-plus免疫印跡發(fā)光劑購于美國Amersham公司;RPMI1640購自Gibco/BRL公司;小牛血清購自杭州四季青公司;塞來昔布(以DMSO為溶媒)購自輝瑞制藥有限公司;阿霉素購自Pharmacia公司;細胞培養(yǎng)箱及超低溫冰箱(Forma公司);倒置顯微鏡(Olympus公司);PCR儀(ABI公司);凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司);電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜設(shè)備(Bio-Rad公司)。
1.2.1 骨髓單個核細胞分離 取樣本骨髓液5 ml,低分子肝素抗凝,緩慢加入已裝有5 ml人淋巴細胞分離液的離心管中,以2000 r/min離心20 min,提取中間單個核細胞置于1.5 ml EP管中,加入PBS液1 ml吹打混勻,以3000 r/min離心10 min,棄上清液,置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 細胞培養(yǎng) U266細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度條件,于含10%小牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基中培養(yǎng),每2~3天傳代1次;MCF-7/Adr細胞在上述培養(yǎng)條件下,每2~3天傳代1次,以0.2 μg/ml的阿霉素維持其特性。
1.2.3 RNA提取及RT-PCR Trizol提取法提取細胞總RNA,紫外線分光光度計定量,將4 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR,基因引物由上海生物工程公司合成,序列如下:COX-2正義鏈:5’-ATCCTTGCTGTTCCCACCCA-3’,反義鏈:5’- CTTTGACACCCAAGGGAGTC -3’,退火溫度54.5℃,目的基因片段長度為402 bp;VEGF正義鏈:5’- CTTGCTGCTCTACCTCCAC -3’,反義鏈:5’- AAATGCTTTCTCCGCTCTG -3’,退火溫度55℃,目的基因片段長度為420 bp;β-actin正義鏈:5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC -3’,反義鏈:5’- CATGTCTCGATCCCACTTAAC -3’,退火溫度59℃,目的基因片段長度為330 bp。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃,5 min,然后94℃ 30 s;退火30 s,72℃,30 s,共30循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下照相,凝膠成像分析系統(tǒng)掃描定量。以β-actin為內(nèi)參照。
1.2.4 蛋白提取及Western-blotting 應(yīng)用Neuclear/cytosol Fractionation Kit 進行蛋白提取(按說明操作),紫外線分光光度計測定蛋白的吸光值,通過標準曲線求得蛋白濃度,各取30 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳,積層膠的濃度5%,分離膠的濃度8%,80V電泳至積層膠和分離膠分界處,調(diào)電壓為100V直至電泳結(jié)束,90 mA電轉(zhuǎn)過夜至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加入兔抗人COX-2多克隆抗體(1:300)、兔抗人VEGF多克隆抗體(1:300)、兔抗人GAPDH多克隆抗體(1:2000);4℃孵育過夜,1×TBST溶液洗膜,加入HRP山羊抗兔二抗(1:10000),室溫輕搖2 h,洗膜,多功能激光掃描成像系統(tǒng) (Typhoon 9400 Variable Mode Imager)掃描并定量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照。
1.2.5 MTT 取U266細胞,按1×105/孔接種于96孔板中,加入不同濃度的塞來昔布,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,終體積為200 μl/孔,置5%CO2、飽和濕度、37℃條件下培養(yǎng),48 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,加DMSO 100 μl/孔,水平搖床上搖動10 min,使顆粒完全溶解,酶標儀490 nm處測吸光(OD)值,據(jù)OD值計算不同濃度塞來昔布對U266細胞的生長抑制率,軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。
WB法檢測顯示,在43例MM患者中COX-2陽性表達22例(51.2%),其中Ⅰ期3例,Ⅱ期患者6例,Ⅲ期患者13例;VEGF陽性表達27例(62.8%),Ⅰ期5例,Ⅱ期患者8例,Ⅲ期患者14例;COX-2及VEGF的表達均隨疾病ISS分期的提高而進行性增強,各期患者間存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001);43例患者中18例共表達COX-2及VEGF,兩者的表達具顯著的正相關(guān)(γ=0.874,P<0.001);在11例同期住院的非血液腫瘤骨髓中無COX-2表達,2例VEGF微弱表達(圖1、表1)。
圖1 多發(fā)性骨髓瘤患者中COX-2與VEGF蛋白的表達電泳圖
注:1為正常對照組;2為Ⅰ期MM患者;3為Ⅱ期MM患者;4為Ⅲ期MM患者
表1 多發(fā)性骨髓瘤患者COX-2與VEGF蛋白表達定量
注:Ⅱ期 Ⅲ期與Ⅰ期間相比較,*為P<0.001;Ⅲ期與Ⅱ期相比較,☆為P<0.001
WB檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨年齡、β2-微球蛋白(β2-MG)、血鈣(Ca)及骨髓中漿細胞百分比(BMPC)的增加,COX-2及VEGF的表達增強。年齡≥65歲、β2-MG≥4 mg/l、Ca≥3 mmol/l及BMPC≥40%的MM患者,COX-2及VEGF的表達顯著高于65歲以下、β2-MG <4 mg/l、Ca<3 mmol/l及BMPC<40%的MM患者(表2),統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.001)。相關(guān)分析顯示,年齡、β2-MG、Ca及BMPC等4項預(yù)后指標[3,4]與COX-2表達總的相關(guān)系數(shù)分別為0.692,0.791,0.571及0.856,與VEGF表達總的相關(guān)系數(shù)分別為0.731,0.645,0.511及0.823,均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.001)。年齡、β2-MG、Ca及BMPC在不同的階段與COX-2及VEGF表達也呈現(xiàn)顯著的正相關(guān),見表2。
RT-PCR發(fā)現(xiàn),COX-2及VEGF mRNA在U266細胞中均存在較強表達,與在陽性對照MCF-7/Adr細胞中的表達無差異(P>0.05);WB結(jié)果發(fā)現(xiàn),COX-2及VEGF蛋白表達與mRNA表達相一致。
塞來昔布作用U266細胞48 h,半數(shù)抑制濃度(IC50)為54.41 μmol/L。本實驗選用塞來昔布10 μmol/L及20 μmol/L 2個濃度(對U266細胞生長無明顯抑制)進行后續(xù)實驗。
與未處理組相比,RT-PCR結(jié)果顯示塞來昔布10 μmol/L及20 μmol/L作用48 h后VEGF mRNA表達明顯下調(diào),統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.01),且10 μmol/L及20 μmol/L塞來昔布組間也存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。WB結(jié)果可見VEGF蛋白表達與mRNA表達相一致,表明塞來昔布可明顯下調(diào)VEGF的表達,呈現(xiàn)塞來昔布劑量依賴性(圖2、圖3)。
圖2 塞來昔布作用于U266細胞對VEGF mRNA的影響
注:1為Marker; 2為U266;3為U266+塞來昔布10 μmol/L; 4為U266+塞來昔布20 μmol/L;5為MCF-7/Adr
圖3 塞來昔布作用于U266對VEGF蛋白表達的影響
注:1為U266;2為U266+塞來昔布10 μmol/L; 3為U266+塞來昔布20 μmol/L; 4為MCF-7/Adr
表2 COX-2及VEGF陽性表達與多發(fā)性骨髓瘤臨床預(yù)后指標的相關(guān)性
注:COX-2表達的比較,*為P<0.001;VEGF表達的比較,☆為P<0.001
COX-2是1種誘生性酶。脂多糖、生長因子、細胞因子和癌基因等可迅速而短暫的誘導(dǎo)COX-2表達[5~7],而在正常組織中COX-2表達微弱,在多種人類實體腫瘤組織中則高表達[8]。COX-2除了參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及多藥耐藥外,也與腫瘤的血管新生密切相關(guān)[9~11]。 VEGF作為血管新生的關(guān)鍵因子之一,具有調(diào)節(jié)血管新生、維持腫瘤細胞生存、刺激其增殖、遷移及抵抗凋亡等多種作用,參與腫瘤的進展,已逐漸成為腫瘤的治療靶點。COX-2及VEGF在多種實體腫瘤中的研究已相對深入。COX-2與VEGF呈現(xiàn)正相關(guān),對其干預(yù)可產(chǎn)生良好的抗腫瘤效應(yīng)。然而,在血液系統(tǒng)腫瘤-多發(fā)性骨髓瘤中,COX-2與VEGF的相關(guān)性及兩者間的表達調(diào)控研究資料尚不足,明確兩者間的表達調(diào)控,對多發(fā)性骨髓瘤治療靶點的選擇有重要的臨床意義。
本實驗發(fā)現(xiàn),COX-2及VEGF在多發(fā)性骨髓瘤患者中的陽性表達率較非血液腫瘤患者高,分別為51.2%及62.8%,且兩者的表達均隨多發(fā)性骨髓瘤ISS分期提高而進行性增高,此提示兩者可能與多發(fā)性骨髓瘤患者的疾病進展相關(guān)。
Greipp等[3]在單因素分析的基礎(chǔ)上提供了與MM預(yù)后相關(guān)的指標,包括β2-MG、肌酐(Cr)、年齡、血小板(Plt)、乳酸脫氫酶(LDH)、血紅蛋白(Hb)、血清白蛋白(Alb)、BMPC及血鈣。閆驊等[4]在單因素分析基礎(chǔ)上,篩選出相對有意義的指標,包括性別、年齡、外周血白細胞、血紅蛋白、血小板、血鈣濃度、血清肌酐、血清白蛋白、異常免疫球蛋白分型、骨損與否及骨髓象原始+幼稚漿細胞和成熟漿細胞之比,并利用Cox’s proportional hazard模型作進一步分析發(fā)現(xiàn),年齡≥65歲、血鈣(Ca) ≥3 mmol/l的MM患者預(yù)后良。β2-MG超過4 mg/l已確定為預(yù)后不良的指標[12]。王豫廉等[13]應(yīng)用Log-rank和COX回歸分析對相關(guān)因素作單因素和多因素分析,發(fā)現(xiàn)BMPC≥40%的MM患者較<40%的患者預(yù)后差。基于以上資料,選擇年齡、β2-MG、Ca及BMPC為MM的預(yù)后指標進行研究。在MM患者中,本實驗應(yīng)用WB方法對COX-2及VEGF進行表達定量,發(fā)現(xiàn)隨年齡、β2-MG、Ca及BMPC的增加,COX-2及VEGF的表達增強。相關(guān)分析顯示,COX-2及VEGF分別與上述4種因素呈現(xiàn)正相關(guān),此提示多發(fā)性骨髓瘤患者中COX-2及VEGF與預(yù)后密切相關(guān),對兩者進行有效干預(yù)可能會起到改善預(yù)后的作用。
在鼠炎癥模型中發(fā)現(xiàn),COX-2可通過PGE2刺激VEGF表達,促進肉芽組織中血管新生,COX-2選擇性抑制劑NS398呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)VEGF的表達[14]。本實驗對多發(fā)性骨髓瘤患者中COX-2與VEGF的表達量進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),COX-2與VEGF呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)(γ=0.874),也提示MM中二者間可能存在表達調(diào)控的關(guān)系;隨后通過多發(fā)性骨髓瘤U266細胞株進行研究,應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對U266細胞株進行干預(yù),發(fā)現(xiàn)可有效抑制VEGF mRNA及蛋白的表達,呈現(xiàn)塞來昔布劑量依賴性,其具體的作用機制尚不清,有待進一步研究。
綜上所述,COX-2及VEGF在多發(fā)性骨髓瘤中高表達,兩者與MM的ISS分期及預(yù)后密切相關(guān),可作為病情評估的重要指標;干預(yù)COX-2可部分下調(diào)VEGF的表達,COX-2可望成為多發(fā)性骨髓瘤治療的1個有效的靶點。
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