PS-341對人類宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡作用的研究

張丹丹 張玉泉 季玉琴 周業(yè)娣 糜媛媛

近年來，有研究表明HPV的E6、E7編碼蛋白，通過不同的泛素-蛋白酶體途徑導(dǎo)致宮頸細(xì)胞癌變，其中HPV E6-E6AP-P53途徑是目前研究最多的途徑，已能在體外完全模擬建。

泛素-蛋白酶體途徑作為HPV導(dǎo)致宮頸癌的重要機(jī)制，研究該途徑的抑制劑對宮頸癌的治療可能產(chǎn)生巨大影響，硼替佐米(bortezomib,PS-341)是首個被用于臨床的蛋白酶體抑制劑。本實驗旨在觀察PS-341對宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞毒性影響的研究，為臨床治療提供有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

人類宮頸癌SiHa細(xì)胞株，購于上海拜力生物科技有限公司。購買的人宮頸癌SiHa細(xì)胞株接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，包裝無破損，鏡下觀察形態(tài)正常，放量37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM完全培養(yǎng)液(南京基然生物科技發(fā)展有限公司)培養(yǎng)，0.25%胰酶(南京基然生物科技發(fā)展有限公司)消化傳代。

1.2 藥物及試劑

注射用硼替佐米(萬珂)，美國Ben Venue Laboratories Inc.生產(chǎn)，西安揚森制藥有限公司分裝，進(jìn)口藥品注冊證號：H20050308，分裝批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20050042。購于南京眾協(xié)藥房有限公司，用無菌水稀釋成1 mg/ml備用。Hoechst染色試劑盒購于海門碧云天生物科技研究所，Annexin-V FITC kit試劑盒和細(xì)胞DNA(細(xì)胞周期)檢測試劑盒，均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡

將干凈無菌的蓋玻片置于6孔板內(nèi),接種細(xì)胞過夜。當(dāng)細(xì)胞鋪滿蓋玻片50%～80%時,依次加入0 nmol/L、20 nmol/L 、40 nmol/L 、60 nmol/L PS-341，分別作用24、48、72 h后,吸盡培養(yǎng)液,加入0.15 ml的固定液,固定過夜。去固定液,用PBS 洗2 遍,每次3 min,吸盡液體,加入0.5 ml Hoechst染色液,避光染色5 min,晃動數(shù)次,封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.4 FCM測定細(xì)胞凋亡率

取對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)(每孔1 800 μl細(xì)胞懸液，加藥200 μl)，待細(xì)胞貼壁后給予干預(yù)因素，作用后用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液并收集細(xì)胞于離心管中，2 000 rpm離心5 min，吸棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 rpm離心5 min)，收集1～5×105個細(xì)胞，加入500 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl Propidium Iodide，混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15 min。1h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。實驗重復(fù)3次，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 FCM測定細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)(每孔1 800 μl細(xì)胞懸液，加藥200 μl)，待細(xì)胞貼壁后給予干預(yù)因素，作用后用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液并收集細(xì)胞于離心管中，2000 rpm離心5min，吸棄上清。PBS洗滌細(xì)胞1次，2000 rpm離心5 min，吸棄上清，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，制備的單細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇固定，4℃保存過夜。染色前用PBS洗去固定液，加100 μl RnaseA 37℃水浴30 min，再加100 μl PI染色混均，4℃避光30 min。上機(jī)檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。實驗重復(fù)3次，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst染色結(jié)果

未加入PS-341作用的SiHa細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，大小正常，染色稀疏，并且不隨著時間的改變而發(fā)生變化。20 nmol/L PS-341作用24 h后，即發(fā)生細(xì)胞核固縮濃染，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變，并且隨著PS-341作用濃度的增高，細(xì)胞核固縮濃染數(shù)目逐漸增多，形態(tài)學(xué)改變越來越明顯。加入相同濃度的PS-341后，隨著作用時間的延長，細(xì)胞核固縮濃染的數(shù)目也越來越多，凋亡現(xiàn)象越來越明顯，60 nmol/L PS-341作用72 h后，細(xì)胞核已完全呈碎裂狀致密濃染。

2.2 FCM測定細(xì)胞凋亡率

不同濃度PS-341作用不同時間后，與陰性對照組比較，SiHa細(xì)胞早期凋亡率顯著增高(P<0.01)；隨著作用濃度的升高和作用時間的延長，早期凋亡細(xì)胞比例逐漸增大，20 nmol/L PS-341作用48 h與作用72 h比較，早期凋亡細(xì)胞比例增大(P<0.05)，其余各組間比較，早期凋亡細(xì)胞比例明顯增大(P<0.01)；60 nmol/L PS-341作用72 h時，早期細(xì)胞凋亡率為68.07%，與其他組相比顯著增高(P<0.01)。實驗組中PS-341濃度為60 nmol/L、作用時間為72 h時，對SiHa細(xì)胞的凋亡作用最強(qiáng)，見圖1，表1。

表1 不同濃度PS-341作用不同時間SiHa細(xì)胞凋亡情況

﹡為與陰性對照組相比，P<0.01；△為與48h相比，P<0.05；其余組間相比，P<0.01

2.3 FCM測定細(xì)胞周期

不同濃度PS-341作用SiHa細(xì)胞不同時間后，與對照組比較，G0/G1期細(xì)胞比例增大(P<0.01)，S期細(xì)胞比例下降(P<0.01)。隨PS-341濃度增高和作用時間的延長，G0/G1期細(xì)胞所占比例與細(xì)胞凋亡率呈同步變化趨勢，而S期細(xì)胞比例則隨作用濃度升高和作用時間延長而逐漸下降,60 nmol/L PS-341作用48 h與作用24 h相比，S期細(xì)胞比例下降(P<0.05)，其余各組相比，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高，S期細(xì)胞比例下降，細(xì)胞生長阻滯于G0/G1期，各組間差異顯著(P<0.01)，見圖2，表2。

圖1 不同濃度PS-341作用不同時間對SiHa細(xì)胞凋亡率的影響

圖2 不同濃度PS-341作用不同時間對SiHa細(xì)胞周期的影響

PS-341濃度(nmol/L)24 hG0/G1SG2/M48 hG0/G1SG2/M72 hG0/G1SG2/M0(陰性對照組)52.68±0.9837.43±1.1310.87±0.8551.34±1.0238.37±0.639.89±0.7452.37±0.8636.85±1.0410.12±0.942059.86±0.73﹡30.56±0.919.98±0.8865.35±1.16﹡26.64±1.039.47±0.9670.98±0.62﹡21.54±0.83﹡8.49±0.974068.04±1.13﹡23.78±0.95﹡9.02±0.7873.03±0.67﹡18.33±1.02﹡9.53±0.8978.61±1.06﹡11.23±0.95﹡10.24±0.816080.76±0.97﹡7.31±0.81﹡11.73±1.0885.14±0.62﹡5.62±1.02﹡△9.08±0.7688.47±0.58﹡3.53±0.79﹡8.01±0.94

﹡為與陰性對照組相比，P<0.01; △為與作用24h相比，P<0.05，其余各組間相比，P<0.01

3 討論

經(jīng)過大量的研究調(diào)查，目前認(rèn)為HPV是宮頸癌的主要致病因子[1]，國外Nubia Munoz等[2]，國內(nèi)陳少敏等[3]均有報道絕大部分宮頸癌中均可發(fā)現(xiàn)有HPV感染。近年來在研究HPV的過程中，有報道HPV可通過泛素-蛋白酶體途徑導(dǎo)致宮頸細(xì)胞癌變，其中HPV E6-E6AP-P53是一條相當(dāng)重要的途徑。Hougardy 等[4]將26S蛋白酶體抑制劑MG132與細(xì)胞凋亡刺激因子rhTRAIL(人復(fù)合TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)聯(lián)合作用于宮頸癌多種細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中野生型p53的表達(dá)量增加，并且對細(xì)胞凋亡刺激因子rhTRAIL敏感性增強(qiáng)。因此，能否從HPV的致癌機(jī)制入手，通過抑制途徑中的關(guān)鍵步驟來找到治療宮頸癌最佳方案。

目前，在26S蛋白酶體抑制劑中，PS-341已被美國FDA批準(zhǔn)將該藥用于治療復(fù)發(fā)性、難治性多發(fā)性骨髓瘤。因此，本人選用該藥作為本課題的研究用藥。人類宮頸癌SiHa細(xì)胞來源于人宮頸上皮鱗狀細(xì)胞癌，腫瘤分期Ⅱ級，NF-κB活性較強(qiáng)，p53+，為感染HPV16型，HPV16屬于高危型HPV，符合本實驗要求。本課題進(jìn)行體外實驗，將不同濃度的PS-341作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞系，并設(shè)定不同的作用時間，以觀察PS-341對宮頸癌SiHa細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)凋亡作用，以及誘導(dǎo)作用與PS-341濃度、作用時間之間的關(guān)系

Hoechst染色以及FCM測細(xì)胞早期凋亡率的實驗結(jié)果均提示PS-341對SiHa細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，并且誘導(dǎo)凋亡作用與作用濃度、作用時間呈正比。FCM測定細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，與陰性對照組的SiHa細(xì)胞相比，加入PS-341的處理組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞所占比例隨著濃度的增加及作用時間的延長而逐漸上升，而S期細(xì)胞的比率則隨著濃度的增加及作用時間的延長則逐漸下降。有文獻(xiàn)提示PS-341將細(xì)胞周期停止于G2/M期[5]，但Fujita 等[6]在研究PS-341對胃癌細(xì)胞治療作用的研究中提示，小劑量的PS-341將細(xì)胞周期阻滯于G1期。本實驗中本實驗提示PS-341誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞阻滯于G0/G1期,表明PS-341抑制skov-3細(xì)胞DNA前期的合成，阻滯細(xì)胞進(jìn)入周期復(fù)制，從而引起細(xì)胞凋亡。

UPP通過26S蛋白酶體降解一些與凋亡相關(guān)的蛋白,如轉(zhuǎn)錄因子,凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等,發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，目前蛋白酶體降解蛋白的機(jī)制還不十分清楚。有研究表明，泛素中的E3RNG家族成員癌基因調(diào)節(jié)蛋白鼠雙微粒體(murine double minute 2,MDM2) 是1種癌基因蛋白，具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)p53的作用。MDM2 含有環(huán)指樣結(jié)構(gòu)域,具有泛素連接酶E3 的作用 ,可以促進(jìn)p53產(chǎn)物從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運,使之被泛素化后被26S蛋白酶體降解[7]。抑癌基因p53的表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡調(diào)控因子。該產(chǎn)物可以通過激活一系列靶基因,如下調(diào)bcl22的活性,上調(diào)bax活性,誘導(dǎo)死亡受體的Fas基因和FasL的表達(dá)等實現(xiàn)凋亡調(diào)控功能。本實驗在體外初步證實了PS-341可誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯于G1期，并且隨著PS-341濃度的不同、作用時間的不同，對細(xì)胞的作用能力亦不相同。在本實驗所設(shè)定的濃度及作用時間顯示，濃度越高，作用時間越長，其對SiHa細(xì)胞的影響越大。當(dāng)然，對于PS-341對SiHa細(xì)胞的作用、影響，還有待進(jìn)一步研究，其作用機(jī)制、最佳作用時間及最佳作用濃度等問題還有待解決。

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