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    雷公藤紅素逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥的實驗研究

    2011-06-07 07:34:16馬保根翟亞萍李玉龍
    實用癌癥雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:紅素阿霉素雷公藤

    胡 婕 張 茵 馬保根 翟亞萍 李玉龍 程 薇

    白血病是造血系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,目前常用的治療方法是化療,雖然化療能使多數(shù)患者達(dá)到緩解,但仍有大部分患者因為化療失敗而死亡。導(dǎo)致化療失敗的原因有很多,其中最主要的是白血病細(xì)胞的多藥耐藥(MDR)性的產(chǎn)生。這也是國內(nèi)目前研究的熱點(diǎn)。

    雷公藤紅素(celastrol)是1種三萜類天然化合物,又名南蛇藤素,具有免疫抑制、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞體外增值、抑制HMC-1細(xì)胞的黏附及其黏附分子表達(dá),雷公藤紅素還能體外誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299、人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤株、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等腫瘤的凋亡。最近有報道雷公藤紅素為1種蛋白酶體抑制劑[1]。本實驗對雷公藤紅素逆轉(zhuǎn)K652/A02細(xì)胞多藥耐藥進(jìn)行探討。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株來源

    人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病急粒變耐阿霉素K562/A02細(xì)胞株由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院紀(jì)春巖教授惠贈。人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病急粒變K562細(xì)胞株由鄭州大學(xué)干細(xì)胞中心常規(guī)傳代培養(yǎng)。

    1.2 主要儀器和試劑

    雷公藤紅素(Celastrol,Solarbio 純度>98%)以DMSO(Sigma公司)助溶為1 mmol/L濃度保存于-20℃冰箱備用;CCK-8試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;P-gp抗體為上海晶天生物科技有限公司產(chǎn)品;阿霉素(ADM)為浙江海正藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;維拉帕米為上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基為GIBCOBRL公司產(chǎn)品;新生牛血清為杭州四季青產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀(FACSCalibur )為美國BD公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀(Bio-RAD680)。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,K562/A02細(xì)胞培養(yǎng)于含阿霉素(1 μmol/L)的上述培養(yǎng)基中,將2種細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),2~3天傳代1次,其中K562/A02細(xì)胞在實驗前兩周改用無阿霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。實驗分組如下:①K562細(xì)胞+ADM; ② K562細(xì)胞+雷公藤紅素;③K562/A02細(xì)胞+ADM;④ K562/A02細(xì)胞+雷公藤紅素;⑤ K562/A02細(xì)胞+ADM+雷公藤紅素。

    1.3.2 CCK-8法檢測ADM、雷公藤紅素的細(xì)胞毒性及耐藥細(xì)胞的耐藥倍數(shù) 取對數(shù)生長期的K562和K562/A02細(xì)胞(2~3×104cell/孔)于96孔板中,由高到低濃度分別加入ADM(160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L),雷公藤紅素(320、160、80、40、20、10、5、2.5 μmol/L),每孔設(shè)3個平行孔,終體積為150 μl。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,每孔加入CCK-8試劑10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,以空白孔調(diào)零,全自動酶標(biāo)儀于450 nm處測吸光度值,參比波長為650 nm,采用SPSS16.0軟件計算生長抑制率50%時的藥物濃度即半數(shù)抑制率(IC50)[2,3]。抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%;耐藥倍數(shù)=(耐藥細(xì)胞的IC50/敏感細(xì)胞的IC50)。實驗重復(fù)3次,取平均值。

    1.3.3 CCK-8法檢測雷公藤紅素耐藥逆轉(zhuǎn)性 取對數(shù)生長期的K562/A02細(xì)胞(2~3×104個細(xì)胞/孔)于96孔板中。實驗分組:①K562/A02,②K562/A02+雷公藤紅素,③K562/A02+VLP。所加ADM等藥物濃度同上,每孔設(shè)3個平行孔,終體積為150 μl。并用維拉帕米(VLP)組5 μg/L作為陽性對照[4]。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h后加入10 μl CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,以空白孔調(diào)零,檢測波長同上。計算半數(shù)抑制率(IC50)。實驗重復(fù)3次。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=(耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)前的IC50/耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)后的IC50)。

    1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測K562和K562/A02細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度 取對數(shù)生長期細(xì)胞于24孔板中,實驗分6組:① K562/A02,② K562/A02+ADM,③ K562/A02+ADM+雷公藤紅素(IC10),④ K562/A02+ADM+雷公藤紅素(IC50),⑤ K562,⑥K562+ADM。第③、④組分別先加入IC10和IC50的雷公藤紅素,24 h后在第②③④⑥組中再加入ADM10 μg/ml,藥物作用3 h,收集細(xì)胞1×106個細(xì)胞,冷PBS(4℃,0.01 mol/L,PH7.4)洗滌2次,再重懸于冷PBS液中,4℃保存至上樣進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長Ex=488 nm,發(fā)射波長Em=575 nm)[5]。

    1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測P-gp表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞于24孔板中,實驗分4組分別為:①K562/A02,②K562/A02+ADM(IC50),③K562/A02+雷公藤紅素(IC50),④K562/A02+ADM(IC50)+雷公藤紅素(IC50);置培養(yǎng)箱孵育48 h后,收集細(xì)胞,約3×105個細(xì)胞,用冷的PBS液洗2遍,按操作說明加入P-gp抗體,室溫下避光孵育30 min后上流式細(xì)胞儀檢測,并給出相應(yīng)的P-gp表達(dá)率。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 雷公藤紅素對K562、K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用

    雷公藤紅素對K562及K562/A02抑制率見表1。雷公藤紅素對K562和K562/AO2細(xì)胞的IC50分別為(411.59±26.551)μmol/L和 (295.58±23.288)μmol/L,兩者差異明顯(P<0.05),說明K562/A02細(xì)胞對雷公藤紅素不具有耐藥性。ADM對K562、K562/A02的IC50分別為(0.749±0.741)μmol/L、(59.755±6.883)μmol/L,耐藥倍數(shù)為79.78倍,說明K562/A02對ADM有明顯的耐藥性(P<0.05)。細(xì)胞毒劑量的雷公藤紅素可降低ADM對K562/A02細(xì)胞的IC50,提高對ADM的敏感性,應(yīng)用雷公藤紅素后,IC50為(0.507±0.070)μmol/L,與單用ADM組比較明顯下降(P<0.05),耐藥性逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)為117.860倍;而加入5 μg/L維拉帕米后的IC50為(17.196±6.303)μmol/L,也明顯低于單用ADM組(P<0.05),RF為3.745,見表2。

    2.2 雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響

    應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測K562/A02細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度。由表3可見加入雷公藤紅素后,細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度明顯增加,加入IC10濃度的雷公藤紅素和IC50濃度的雷公藤紅素后,細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度差異顯著(P<0.05)。

    表1 雷公藤紅素和阿霉素對K562、K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用

    表2 雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)

    注:與K562/A02+ADM組比較,△、☆為P<0.05

    表3 雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度的影響

    注:與第②組比較,※、#為P<0.05;與第③組比較,★為P<0.05

    2.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測P-gp表達(dá)

    從圖1中可見,單用阿霉素對P-gp表達(dá)無明顯影響;但應(yīng)用雷公藤紅素能明顯減弱P-gp的表達(dá),且加用ADM后,P-gp表達(dá)也明顯下降。

    圖1 流式細(xì)胞儀檢測P-gp表達(dá)結(jié)果圖中波峰高度為P-gp的表達(dá)強(qiáng)度

    3 討論

    多藥耐藥(multidrungresistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞對1種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時,對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的其他多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。腫瘤對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR)是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一。目前研究表明MDR的產(chǎn)生有多種機(jī)制,主要有[6]:①腫瘤細(xì)胞表面ATP結(jié)合膜蛋白的表達(dá)增加或活性提高,包括P糖蛋白( P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺抗藥性相關(guān)蛋白(LRP)、乳腺癌抗藥性相關(guān)蛋白(BRCP)等幾類;②谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferase)的表達(dá)增加或活性增強(qiáng);③TOPOⅡ含量減少及活性降低;④蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的表達(dá)增加或活性增強(qiáng);⑤腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。其中P-gp介導(dǎo)的MDR是研究最多最為廣泛的機(jī)制之一,被稱為多藥耐藥的經(jīng)典途徑[7]。

    P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是由位于人7q21.1的多藥耐藥基因1(MDR1)編碼,Juliano在1976年發(fā)現(xiàn)P-gp后,已經(jīng)證實P-gp高表達(dá)為MDR的主要機(jī)制。P-gp可以通過它的疏水位點(diǎn)與疏水性抗腫瘤藥物結(jié)合,通過ATP水解供能,逆濃度梯度將藥物泵出細(xì)胞外;還可以使從而使藥物濃度低于殺傷濃度;還可以使藥物在細(xì)胞內(nèi)再分布,導(dǎo)致藥物聚集于與藥物作用無關(guān)的細(xì)胞器如溶酶體內(nèi),從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生MDR[8]。P-gp蛋白的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞膜上蛋白的表達(dá)量成正比。

    雷公藤紅素對多種腫瘤細(xì)胞有殺滅作用和對腫瘤血管的生成有直接抑制作用,其抑瘤率達(dá)65%~93%,已超過紫杉醇[9]。但是其阻滯細(xì)胞周期[10]、激活經(jīng)典凋亡途徑的毒性也限制了它的使用[11]。本研究顯示雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞有抑制作用,為進(jìn)一步觀察雷公藤紅素逆轉(zhuǎn)的機(jī)制,運(yùn)用流式細(xì)胞儀對MDR1所表達(dá)的P-gp及其功能進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示細(xì)胞毒劑量的雷公藤紅素能明顯降低P-gp的表達(dá),而且用雷公藤紅素后,細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度明顯增加,并與所加雷公藤紅素的劑量呈正相關(guān),提示雷公藤紅素由于下調(diào)了P-gp的表達(dá),使其將化療藥泵出細(xì)胞的功能受抑,使化療藥在白血病細(xì)胞內(nèi)能達(dá)到有效地濃度,從而可以殺死白血病細(xì)胞,達(dá)到逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥的目的。但是經(jīng)典的抗腫瘤藥物或低毒的中藥制劑在臨床應(yīng)用中仍受到劑量的限制。本研究實驗結(jié)果表明雷公藤紅素在體外可以達(dá)到很好的逆轉(zhuǎn)效果,為臨床應(yīng)用提供了一個實驗依據(jù),但體內(nèi)能否達(dá)到類似的逆轉(zhuǎn)效果有待進(jìn)一步的工作。

    [1] Yang HJ,Chen D,Cui QZ,et al.Celastrol,a Triterpene Extracted form the Chinese“Thunder of God Vine,”Is a potent Proteasome inhibitor and Suppresses Human Prostate Cancer Growth in Nude Mice 〔J〕.Cancer Res,2006,66(9):4758.

    [2] 趙 斌,葛金芳,朱娟娟,等.小議在MTT法測細(xì)胞增殖抑制率中IC50的計算方法〔J〕.安徽醫(yī)藥,2007,11(9):834.

    [3] 周一平.用SPSS軟件計算新藥的LD50〔J〕.藥學(xué)進(jìn)展,2003,27(5):314.

    [4] 孫海英,李德志,徐開林,等.硼替佐米對白血病K562/A02細(xì)胞藥物增敏效應(yīng)的實驗研究〔J〕.中華血液學(xué)雜志,2009,30(1):58.

    [5] 王 婷,雙躍榮,莊小捷,等.川芎嗪聯(lián)合三氧化二紳逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞多要耐藥的實驗研究〔J〕.實用癌癥雜志,2009,24(2):121.

    [6] 于 韜,趙桂森,臧恒昌,等.腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑研究進(jìn)展〔J〕.中國藥物化學(xué)雜志,2003,13:172.

    [7] Norgaard JM,Hokland P.Biology of multiple drug resistance in acute leukemia〔J〕.Int J Hematol,2000,72:290.

    [8] 陳孝堂,陳 筠.P糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥及其逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展〔J〕.山西醫(yī)藥雜志,2007,11:1005.

    [9] 徐錚奎.開發(fā)雷公藤單體成分新藥市場前景廣闊〔J〕.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2006,37(10):130.

    [10] 周幽心,孫成法,許期年,等.雷公藤紅素抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞株增值的體外研究〔J〕.實用癌癥雜志,2004,19(6):564.

    [11] 馮繼明,余燕敏,安增梅,等.雷公藤多甙對成人隱匿性自身免疫性糖尿病患者谷氨酸脫羧酶抗體和B細(xì)胞功能的影響〔J〕.中國醫(yī)藥,2006,1(8):468.

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