黑曲霉糖化酶分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

梁新紅,孫俊良,唐玉,郭祖峰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC 3.2.1.3）,是一種外切型糖苷酶,從淀粉的非還原性末端依次水解α-1,4糖苷鍵,水解下一個(gè)個(gè)葡萄糖單元,工業(yè)上用于將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖,因而廣泛地用于制藥、制酒及氨基酸、有機(jī)酸行業(yè),是最重要的工業(yè)酶制劑之一[1-2].黑曲霉（Aspergillus niger）是生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶重要菌株之一[3-4].發(fā)酵液中糖化酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究對(duì)糖化酶在工業(yè)中應(yīng)用至關(guān)重要[5].本研究擬對(duì)已篩選到的A.niger FJL 0801進(jìn)行分離純化,并研究其酶學(xué)性質(zhì),以豐富糖化酶研究內(nèi)容,為可能的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)新的糖化酶資源.

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：黑曲霉（Aspergillus niger FJL0801）,河南科技學(xué)院食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室冷藏保存.

DEAE-Fast Flow陰離子交換柱（16 mm×100 mm）,Superdex-75層析柱（26 mm×600 mm）,美國惠普公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)酶條件 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基：淀粉 10 g；NaNO32 g；K2HPO41 g；KCl 0.5 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；FeSO4·7H2O0.01 g；蒸餾水 1 000 mL,自然 pH.

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：把發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中,裝液量為80 mL.按5%接種量把半干體培養(yǎng)基接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,于33℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為210 r/min.

1.2.2 糖化酶的分離純化 發(fā)酵液6 000 r/min離心15 min去菌體,所得上清液為粗酶液,總量為200 mL.粗酶液進(jìn)行80%飽和的硫酸銨鹽析沉淀,8 000 r/min離心30 min,沉淀經(jīng)去離子水透析,進(jìn)行冷凍干燥.凍干后,用3mL檸檬酸-磷酸氫二鈉（pH4.5）緩沖液溶解后,上DEAE-52陰離子交換柱（16mm×100mm）,采用10 mmol的Tris-HCl緩沖液（含2 mmol CaCl2,pH8.4）進(jìn)行平衡,上樣后使用含有0～1 mol NaCl的同樣緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,洗脫速度為2 mL/min,收集合并酶活峰后,上預(yù)先經(jīng)10 mmol的Tris-HCl（pH6.5）緩沖液平衡好的Superdex-50層析柱（26 mm×600 mm）進(jìn)行洗脫,洗脫速度2 mL/min,收集合并酶活峰,經(jīng)去離子水透析,凍干,用于酶學(xué)性質(zhì)研究.

1.2.3 糖化酶活力測定方法 粗酶液活力按照GB/T1805.2-93測定[6].

1.2.4 蛋白含量測定 按Bradford方法測定[7],以牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3 酶學(xué)性質(zhì)

1.3.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 在不同溫度下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活,以酶活最高者為100%.熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中測殘余酶相對(duì)活力,以未保溫的酶液的酶活為100%.

1.3.2 酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性 將酶液分別用pH3.0～6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH6.0～8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋,按標(biāo)準(zhǔn)方法測酶活力.

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)平行重復(fù)4次.采用DPSv7.55數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差顯著性進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的分離純化

黑曲霉糖化酶粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-52陰離子交換柱和SephadexG-50凝膠層析后,酶蛋白得到明顯純化.糖化酶的純化結(jié)果如表1.

表1 糖化酶純化結(jié)果

圖1 溫度對(duì)A.niger FJL 0801糖化酶活性的影響

由表1可知,純化后酶的比活力達(dá)到了58.40 U/mg,較粗酶液純化了38.42倍.但在純化過程中,酶活回收率達(dá)到17.45%,酶蛋白的損失主要在DEAE-52陰離子交換柱及SephadexG-50凝膠層析.

2.2 酶的最適反應(yīng)溫度

把經(jīng)分離純化的糖化酶在不同溫度下測定酶的活力,以探索糖化酶最適作用溫度,結(jié)果如圖1.

由圖1可知,A.niger FJL 0801糖化酶在30～60℃的溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高,相對(duì)酶活力（相對(duì)酶活規(guī)定方法：在一定溫度下所測最高酶活,其相對(duì)酶活為100%）逐漸升高,在溫度為60℃時(shí),相對(duì)酶活達(dá)最高100%.反應(yīng)溫度高于60℃后,相對(duì)酶活急劇下降,溫度為70℃時(shí),相對(duì)酶活只有16.57%±0.94%,當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí),酶活為零.因此,糖化酶最適作用溫度為60℃.

2.3 酶的溫度穩(wěn)定性

把經(jīng)分離純化的糖化酶分別在30～60℃下保溫2 h,然后測定其殘留酶活,即為糖化酶在此溫度下穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2.

圖3 pH值對(duì)A.niger FJL 0801糖化酶活性的影響

圖2 A.niger FJL 0801糖化酶的溫度穩(wěn)定性

由圖2可知,糖化酶經(jīng)2 h保溫后,在30～60℃溫度范圍內(nèi)其酶活均有損失,溫度越高,酶活損失越多.在30℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活（在不同溫度下未保溫前測定酶活力的相對(duì)酶活力為100%.然后在同樣溫度下保溫2 h,再次進(jìn)行酶活力的測定,測定殘留酶活與未保溫酶活之比為保溫后的相對(duì)酶活）為92%±3.2%；在最適作用溫度60℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活只有42%±2.8%.因此,在糖化酶應(yīng)用時(shí),應(yīng)同時(shí)考慮酶的最適作用溫度及應(yīng)用溫度的穩(wěn)定性,以達(dá)到最優(yōu)糖化效果.

2.4 酶最適作用pH值

考察在pH值范圍為3.5～7.5的經(jīng)分離純化的A.niger FJL 0801糖化酶的最適反應(yīng)pH值.結(jié)果如圖3.由圖3可知,該酶的的最適反應(yīng)pH值為4.5,在pH4.5～5.5有較高的活力,其相對(duì)酶活（規(guī)定0 h測定酶活值的相對(duì)酶活為100%,其它時(shí)間相對(duì)酶活為測定酶活值與0 h酶活值之比）為100%±4.13%～76.23%±3.25%.在pH為3.5和6.5時(shí),酶活極低,相對(duì)酶活分別只有5.1%±0.26%和6.59%±0.36%,在pH為7.0時(shí),檢測不到酶活,酶活為0.因此,糖化酶最適作用pH值為4.5,酶應(yīng)用中,溶液pH值應(yīng)高于4.0及低于6.0.

2.5 酶的pH值穩(wěn)定性

在pH值為4.5時(shí)60℃保存一定時(shí)間,考察最適作用pH值穩(wěn)定性.保存時(shí)間設(shè)定為0～2 h,結(jié)果如圖4.

由圖4可知,糖化酶在最適作用pH值下,60℃作用糊精溶液0～120 min,其相對(duì)酶活從100%±3.19%降至42%±2.8%,表明在最適作用溫度及pH值下,其酶活力逐漸下降.作用時(shí)間在60 min以內(nèi),其酶活保存89%±2.56%；繼續(xù)增加作用時(shí)間,其酶活保存率較低,從89%±2.56%降至42%±2.8%.因此,在糖化酶應(yīng)用中,在酶的最適溫度和pH值下,應(yīng)掌握好酶的作用時(shí)間.

圖4 A.niger FJL 0801糖化酶的pH值穩(wěn)定性

3 結(jié)論

黑曲霉糖化酶粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-52陰離子交換柱和SephadexG-50凝膠層析后,酶的比活力達(dá)到了58.40 U/mg,較粗酶液純化了38.42倍,酶活回收率達(dá)到17.45%.

經(jīng)分離純化的糖化酶其最適作用溫度為60℃；糖化酶在30℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活為92±3.2%；在最適作用溫度60℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活只有42%±2.8%.

酶的的最適反應(yīng)pH值為4.5,在pH4.5下,60℃作用糊精溶液作用時(shí)間在60 min以內(nèi),其酶活保存89%±2.56%；繼續(xù)增加作用時(shí)間,其酶活保存率較低,從89%±2.56%降至42%±2.8%.

通過糖化酶的最適作用溫度、pH及其穩(wěn)定性研究,其酶學(xué)性質(zhì)基本符合淀粉糖化工業(yè)化過程中對(duì)酶的要求,該酶比較適合應(yīng)用于淀粉糖化工業(yè).

[1]Giordano R L,Trovati J,Schmidell W.Continuous production of ethanol from starch using glucoamylase and yeast co-immobilized in pectin gel[J].Applied Biochemistryand Biotechnology,2008,147（1-3）：47-61.

[2]李旺軍,方華,謝廣發(fā),等.RSM法優(yōu)化Aspergillus oryzae AO-01產(chǎn)糖化酶條件的研究[J].食品科學(xué),2007,28（11）：322-327.

[3]孫俊良,李新華,梁新紅.不同碳源對(duì)黑曲霉產(chǎn)糖化酶活力的影響[J].食品科學(xué),2008,29（8）：433-436.

[4]WangQH,WangXQ,WangXM.Glucoamylase production fromfood waste byAspergillus niger under submerged fermentation[J].Process Biochemistry,2008,43（3）：280-286.

[5]Kumar P,Satyanarayana T.Optimization of culture variables for improving glucoamylase production by alginate-entrappedThermomucor indicae-seudaticaeusingstatistical methods[J].Bioresource Technology,2007,98（6）：1252-1259.

[6]田棲靜,吳炳炎,侯炳炎,等.工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1994：122-127.

[7]韋平和.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)與指導(dǎo)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2003：25-26.