利用siRNA敲除P-選擇素受體CD24對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響

李明 李巖 陳偉強(qiáng) 余雪松

CD24是一種低分子量高度糖基化的蛋白質(zhì)粘附分子，作為P-選擇素的配體之一，CD24參與介導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、血小板之間的粘附。近年來(lái)，臨床研究發(fā)現(xiàn)CD24高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，并且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)［1］。對(duì)于其作用機(jī)制，以往研究較多的集中的CD24與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系上，而CD24在腫瘤增殖中的作用研究尚不十分明確。因此，本實(shí)驗(yàn)用siRNA干擾CD24的表達(dá)，觀察抑制CD24表達(dá)對(duì)細(xì)胞的增殖的影響，初步探討CD24在腫瘤生長(zhǎng)中的作用。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 引物、分子量Marker和質(zhì)粒提取試劑盒(大連 TaKaRa公司);兩步法 RT-PCR試劑盒、Trizol、Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司);抗CD24抗體和抗βactin抗體(美國(guó)Santa Cruze公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce公司);蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、雜交箱和酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。人黑色素瘤細(xì)胞株B16F10為本室保存。靶向CD24的siRNA干擾質(zhì)粒pSi-CD24由本室構(gòu)建，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取備用［2］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人黑色素瘤細(xì)胞B16F10細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，按照說(shuō)明書(shū)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和pSi-CD24組。

1.2.2 B16F10細(xì)胞中CD24 mRNA表達(dá)的變化 轉(zhuǎn)染24 h后，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照說(shuō)明書(shū)以O(shè)ligo-d(T)18為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用特異性引物擴(kuò)增CD24和β-Actin。引物序列和擴(kuò)增方法見(jiàn)本課題組前期發(fā)表的論文［2］。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳，拍照，觀察。

1.2.3 B16F10細(xì)胞中CD24蛋白表達(dá)的變化 轉(zhuǎn)染48 h后按照試劑盒操作步驟提取細(xì)胞總蛋白，取20 μg樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗 CD24(1∶1000)或抗 β-Actin(1∶1000)單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，洗膜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液(1∶3000)37℃孵育1 h，ECL法顯影，常規(guī)洗片拍照。

1.2.4 pSi-CD24對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的影響 取空白對(duì)照組和pSi-CD24組細(xì)胞細(xì)胞，接種至96孔板上，各組設(shè)4孔，在轉(zhuǎn)染后 0、24、48 和 72 h 后加入 MIT(5 mg/m1)20 μl，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 pSi-CD24對(duì)CD24 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在正常情況下，黑色素瘤細(xì)胞B16F10高表達(dá)CD24，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSi-CD24后，B16F10細(xì)胞中CD24 mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯降低，說(shuō)明重組質(zhì)粒pSi-CD24能抑制CD24的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pSi-CD24對(duì)B16F10細(xì)胞CD24表達(dá)的影響

2.2 pSi-CD24對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pSi-CD24質(zhì)粒后，黑色素瘤細(xì)胞B16F10的增值明顯被抑制，在48 h和72 h與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pSi-CD24對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的影響

3 討論

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種簡(jiǎn)單有效的基因沉默工具，主要通過(guò)誘導(dǎo)序列特異性的mRNA降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基因治療和功能基因組學(xué)的研究中［3］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi研究中，通過(guò)質(zhì)粒等表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄形成siRNA具有經(jīng)濟(jì)和容易操作、作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前siRNA最常用的方法。我們前期采用具有RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的pSilencer 3.1載體，成功構(gòu)建了靶向CD24基因的表達(dá)載體pSi-CD24［2］。本實(shí)驗(yàn)用 RT-PCR和 Western blot在黑色素瘤細(xì)胞B16F10中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pSi-CD24質(zhì)粒后細(xì)胞CD24在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組均有明顯降低，說(shuō)明pSi-CD24可以在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)siRNA，高效特異地抑制CD24的表達(dá)，為進(jìn)一步研究CD24基因的功能和以CD24為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)。

作為P-選擇素的配體，CD24高表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在病理情況下CD24和P-選擇素介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與血小板及內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與結(jié)合，腫瘤細(xì)胞與血小板結(jié)合后，形成血小板血栓，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，降低免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷效應(yīng);腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附則有助于腫瘤細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到組織中形成轉(zhuǎn)移灶，因此，CD24/P-選擇素的結(jié)合被認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。還有研究證實(shí)CD24也介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與纖維粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用，敲除CD24可以降低SW620細(xì)胞的粘附能力［5］。CD24對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)也具有調(diào)控作用，Smith等發(fā)現(xiàn)敲除CD24基因?qū)е履[瘤細(xì)胞凋亡增加［6］。有學(xué)者認(rèn)為這與CD24能促進(jìn)腫瘤微血管形成有關(guān)，也有研究認(rèn)為與CD24促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用siRNA技術(shù)敲除黑色素瘤B16F10細(xì)胞CD24基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制CD24表達(dá)可以降低細(xì)胞的增值能力，說(shuō)明CD24可能通過(guò)某些信號(hào)途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。

綜上所述，CD24在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的生長(zhǎng)、粘附和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制CD24表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻礙腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此CD24可能是一個(gè)治療腫瘤的新靶點(diǎn)，但對(duì)其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。

［1］鄒萌萌，吳誠(chéng)義.CD24與乳腺癌及其干細(xì)胞的研究進(jìn)展.中國(guó)普通外科雜志，2008，17(5):480-483.

［2］李明，龔水明，李巖，等.靶向CD24的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建及其沉默效應(yīng)的研究.解剖學(xué)研究，2010，32(3):174-177.

［3］Mello CC，Conte D Jr.Revealing the world of RNA interference.Nature，2004，431(7006):338-342.

［4］Friederichs J，Zeller Y，Hafezi-Moghadam A，et al.The CD24/P-selectin binding pathway initiates lung arrest of human A125 adenocarcinoma cells.Cancer Res，2000，60(23):6714-6722.

［5］鄧啟亮，王新穎，王偉飛，等.抑制CD24表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞粘附能力影響的研究.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2010，23(2):156-159.

［6］Smith SC，Oxford G，Wu Z，et al.The metastasis-associated gene CD24 is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer.Cancer Res，2006，66(4):1917-1922.