腦內(nèi)血管緊張素肽酶活性不對稱性與大鼠行為偏側(cè)的相關(guān)性☆

常崇旺 吳鶴鳴 孫繼明 葛順楠 耿寧 王學(xué)廉

血管緊張素肽酶(angiotensinase)的一種亞型AT4具有類似半胱氨酸氨基肽酶(cystinyl－AP，CysAP)的特性，與血管緊張素IV(ANG IV)結(jié)合具有高特異性和親和力并參與記憶與認知加工［1－2］。海馬是大腦內(nèi)調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶功能的重要區(qū)域。研究表明左側(cè)海馬的膜性丙氨酰氨基肽酶(membrane bound alanylaminopeptidase，MEM－AlaAP)，可溶性半胱氨酸氨基肽酶(soluble bound cystinyl－aminopeptidase，SOL－CysAP)和膜性半胱氨酸氨基肽酶(membrane bound cystinyl－ aminopeptidase，MEM－CysAP)占主導(dǎo)地位［3］。這些結(jié)果使氨基肽酶與記憶的關(guān)系得到進一步確認。另有研究表明，強烈的右手偏利比沒有這種右手偏利被試的記憶力差［4］。這種偏側(cè)行為與記憶的關(guān)系是否有著海馬內(nèi)氨基肽酶分布的內(nèi)在聯(lián)系?為探討這一問題我們進行了如下實驗。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本實驗方案通過第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準。60只成年雄性Wistar大鼠(200～250g)購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。每5只安置于1個標(biāo)準的聚丙烯籠子里。保持在12 h光線/12h(07:00～19:00)黑暗循環(huán)并給予充足的食物和水。

1.2 爪子偏好測試 爪子偏好測試根據(jù)Collins(1985)方法［5］進行了調(diào)整，大鼠入籠大概1周后實施爪子偏好實驗。在兩周內(nèi)不同的日期測試4次，第一次為訓(xùn)練期，根據(jù)其他3次的平均評分分組，右利評分(RPE)≥29分，入右利爪(RH)組;若RPE≤21分，入左利爪(LH)組;若RPE在21至29之間則分入雙利爪(L/R)組［4，6－7］。60 只大鼠經(jīng)過測試后，RH 為36 只，LH 為8 只，L/R為16只。從以上3組大鼠中各隨機抽取6只大鼠進行了RPE的行為學(xué)試驗。

1.3 酶提取和測定 上述RPE行為學(xué)試驗的3組大鼠進行了酶提取和測定測試。組織樣本采集根據(jù)Banegal等人(2005)的研究設(shè)計［3］進行。RPE實驗結(jié)束1周后，在equithensin麻醉下，通過左心室給大鼠腦內(nèi)注入鹽水(2 mL/kg)，將左右海馬的腦組織在干冰保護下解剖并快速取走(＜60 s)，并將左右海馬組織分別勻漿化后再分別放入相同體積的10 mmol/L鹽酸三羥甲基氨基甲烷(HCL－Tris)緩沖液中(PH=7.4)，并分別超高速離心(10000 r/min，30 min，4℃)后將離心液上層的液體取出用于測定膜性丙氨酰氨基肽酶(soluble bound alanyl－aminopeptidase，SOL－AlaAP)/SOL－CysAP 和 MEM－AlaAP/CysAP 的活性和蛋白質(zhì)含量。酶測定方法根據(jù)Banegal等人(2005)的研究設(shè)計［3］進行。以β酰胺基萘酰胺為底物用熒光分析法測定AlaAP和CysAP水平(一式三份)［8－9］。每份上清液在底物溶液中25℃恒溫孵育30 min，加入醋酸鹽緩沖液(1mL，0.1mol/L，PH=4.2)終止反應(yīng)。在酶的作用下β萘酰胺被釋放出來，用熒光分析測量412nm(發(fā)射波長)和345nm(激發(fā)波長)。利用BSA標(biāo)準法測蛋白定量(一式三份)［10］。以每分鐘每毫克蛋白來表達特定可溶的或膜性AT4的活性，熒光分析與水解時間和蛋白質(zhì)含量線性相關(guān)［3］。

1.4 被動逃避行為測試 從3組不同用爪偏好的大鼠中各隨機選出8只大鼠(左利爪為全組大鼠)，共24只大鼠進行了被動逃避行為測試。試驗的盒子包括一個亮室和一個暗室，由中間靠下的一個滑動門分開，第一天將大鼠放入亮室面對暗室，使其適應(yīng)5 min后，將中間的擋板去掉，大鼠可以進入暗室，若大鼠的四只爪子都進入暗室，即通過暗室地板對其進行電刺激，電流0.3 mA，30 V，持續(xù)時間2 s，間隔2 s，循環(huán)5次。在此過程中大鼠均可進入亮室以逃避負性刺激。第二天的基礎(chǔ)過程與第一天一樣，并記錄第一次從亮室進入暗室的潛伏期，定義為“記憶維持(memory retention)”。大鼠進入暗室所用時間記錄為“進入時間(entrance)”。如果大鼠在10s電刺激內(nèi)不離開暗室，則將大鼠取出，如果大鼠沒有在5min內(nèi)進入暗室，則認定潛伏期為300 s。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。通過以下公式計算右側(cè)支配率(%R/T)=右半球/(右半球+左半球)×100%。采用單因素方差分析，雙因素方差分析，鄧肯檢驗(Duncan Test)，配對t檢驗和Pearson’s相關(guān)性分析來進行組間及組內(nèi)數(shù)據(jù)的差異分析及相關(guān)性分析。檢測水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 爪子偏好試驗的行為結(jié)果LH，R/L，RH 3組大鼠，每組各6只，LH組的RPE均數(shù)為12.2±1.2，R/L組的RPE均數(shù)為25.2±0.8，RH組的RPE均數(shù)為35.8±1.5。經(jīng)鄧肯檢驗3組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);左爪偏好與右爪偏好差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。3組大鼠RPE單向方差分析顯示了行為偏側(cè)化的顯著效應(yīng) (F=616.748，P＜0.05)。

2.2 大鼠左右海馬的AlaAP/CysAP活性 進行了右利爪行為測試的大鼠進行了酶提取和測定試驗。這里顯示的是不考慮行為偏側(cè)化條件下的所有老鼠左側(cè)和右側(cè)海馬的AlaAP/CysAP的活性。如表 1示，左側(cè)海馬的 SOL－AlaAP/CysAP和 MEMAlaAP/CysAP活性較右側(cè)高(P＜0.05)。

2.3 不同用爪偏好大鼠左右海馬的AlaAP/CysAP的活性 見表2。3組大鼠左側(cè)海馬的SOL－CysAP和MEM－AlaAP/CysAP活性均較右側(cè)高(P＜0.05)。行為偏側(cè)化與左右側(cè)海馬氨基肽酶活性的相互作用僅僅在 SOL－CysAP［F(2，30)=46.606，P ＜0.05］和 MEM－CysAP［F(2，30)=3.762，P ＜0.05］是有統(tǒng)計學(xué)意義的。個體組間比較揭示L/R大鼠左側(cè)海馬的SOL－AlaAP活性比RH或者LH的大鼠高(P＜0.05)，MEM－AlaAP的活性比RH大鼠高(P＜0.05)。LH大鼠左側(cè)海馬SOL－CysAP和MEM－CysAP活性較L/R大鼠或RH大鼠高(P＜0.05)。L/R大鼠右側(cè)海馬SOL－AlaAP/Cy－sAP和 MEM－AlaAP/CysAP活性較 LH 或 RH 大鼠高(P＜0.05)。

表1 實驗組大鼠左右側(cè)海馬的SOL-AlaAP/CysAP和MEM-AlaAP/CysAP活性及差異檢驗(n=18)nmol/(min.mg)

表2 不同爪偏好大鼠左右側(cè)海馬的SOL-AlaAP/CysAP和MEM-AlaAP/CysAP活性及差異檢驗nmol/(min.mg)

2.4 大鼠海馬CysAP/AlaAP的%R/T活性 行為偏側(cè)化對海馬區(qū) SOL－AlaAP［F(2，17)=0.105］的活性沒有影響(P ＞0.05)(圖1)，而對 MEM－AlaAP［F(2，17)=18.151，P ＜0.05］的%R/T活性具有影響。兩組間的個體比較顯示L/R大鼠MEM－AlaAP和SOL－CysAP的活性高于RH和LH的大鼠(P＜0.05)。L/R老鼠的 MEM－AlaAP［F(2，17)=18.151，P ＜0.05］的%R/T 活性也高于RH和LH的大鼠(P＜0.05)。

2.5 大鼠個體之間CysAP/AlaAP活性的%R/T及RPE分數(shù)的相關(guān)性 SOL－AlaAP和MEM－AlaAP和RPE評分的相關(guān)沒有統(tǒng)計學(xué)意義。而 RPE 評分與 SOL－CysAP［F(r= －0.904，n=18，P ＜0.05)和 MEM－CysAP［F(r= －0.500，n=18，P ＜0.05)成一種負相關(guān)關(guān)系。表明行為選擇和半球不對稱性與大鼠海馬區(qū)內(nèi)CysAP的活性密切相關(guān)。

2.6 大鼠被動逃避行為測試的結(jié)果被動逃避行為測試的結(jié)果顯示(圖2)，分組對大鼠進入暗室的潛伏期的影響不顯著。但是在各組之間對照顯示LH的大鼠進入暗室的潛伏期顯著高于RH的大鼠(P＜0.05)。

3 討論

圖1 左爪偏好(LH)、雙爪偏好(L/R)及右爪偏好(RH)大鼠優(yōu)勢半球的 R/T及 SOL－AlaAP/CysAP和 MEM－AlaAP/CysAP活性比較(n=18)。柱形圖上的垂直線表示標(biāo)準差異，*表示P＜0.05(經(jīng)鄧肯檢驗)

本研究的目的是發(fā)現(xiàn)行為偏側(cè)化與大腦內(nèi)血管緊張素酶AlaAP和CysAp(特別是CysAp，即AT4)活性的關(guān)系。我們的數(shù)據(jù)提示AT4的活性與個體優(yōu)勢爪的評分成一種負相關(guān)關(guān)系。

AT4 以優(yōu)先結(jié)合 ANGIV 為特點［1，11－12］，這種 ANG IV/AT4 系統(tǒng)在與認知和記憶過程相聯(lián)系的大腦結(jié)構(gòu)中非常重要:首先，研究發(fā)現(xiàn)大鼠、豚鼠和猴子的海馬內(nèi)均具有AT4受體高密度分布的區(qū)域，而海馬區(qū)與記憶密切相關(guān)［13－14］。其次，有報告指出腦室內(nèi)注射ANGIV可以影響海馬功能，因為這可以選擇性激活海馬區(qū)內(nèi)錐體細胞和顆粒細胞的c－Fos免疫應(yīng)答反應(yīng)［15－16］。第三，對抗AT4受體可以破壞大鼠聯(lián)合與空間記憶的維持而ANGIV可以易化這些過程［11］。這些結(jié)果強烈提示海馬區(qū)血管緊張素酶(AlaAP和CysAp)在學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)節(jié)過程中有重要作用。

圖2 左爪偏好(LH)、雙爪偏好(L/R)及右爪偏好(RH)大鼠的被動逃避行為測試結(jié)果(n=24)。時間(秒，s)表示大鼠進入暗室的時間及進入暗室的潛伏期的時間。柱形圖上的垂直線表示標(biāo)準差異，*表示P＜0.05(經(jīng)鄧肯檢驗)。

然而AT4受體的本身和其配體調(diào)節(jié)其反應(yīng)的機制迄今仍不明確［1］。我們發(fā)現(xiàn)左側(cè)海馬區(qū)有較高的AlaAP和CysAP活性水平，提示相對重要的功能分布于左側(cè)。典型的大腦偏側(cè)優(yōu)勢與左腦的語言優(yōu)勢相聯(lián)系，在此研究擁有較高水平AT4活性的左側(cè)海馬在易化學(xué)習(xí)和記憶中可能比右側(cè)海馬更為重要。AT4成分與大腦偏側(cè)化相聯(lián)系。我們一般的認為LH大鼠有右腦優(yōu)勢，RH大鼠有左腦優(yōu)勢，此研究發(fā)現(xiàn)LH大鼠相比于RH大鼠在左側(cè)的海馬區(qū)內(nèi)有較高的CysAP水平。但并沒有在LH大鼠和RH大鼠右側(cè)海馬發(fā)現(xiàn)顯著差異。

用優(yōu)勢爪實驗研究偏側(cè)化可使偏側(cè)化研究量化和客觀。此研究揭示海馬活性半球優(yōu)勢同側(cè)水平的優(yōu)勢爪之間的關(guān)系。第一次顯示了AT4活性左右側(cè)海馬的差異性與個體RPE評分的線性負相關(guān)性。即AT4活性的左右側(cè)差異越大則個體的RPE評分越低，LH大鼠的AT4活性的左右側(cè)差異最大。

被動逃避行為是測試長期記憶的一個指標(biāo)。在此研究中，LH大鼠表現(xiàn)出來的記憶維持時程長于RH大鼠，根據(jù)行為偏側(cè)化條件下AlaAP和CysAP活性總的結(jié)果，我們認為LH大鼠的AT4活性更高而且表現(xiàn)的腦記憶功能更優(yōu)秀。

左側(cè)海馬區(qū)較右側(cè)海馬區(qū)AlaAP和CysAP的活性水平高，同時CysAP活性的不對稱與大鼠行為的方向和強度密切相關(guān)。我們僅僅初步了解了AT4活性到優(yōu)勢爪通路的現(xiàn)象，對其可能的作用、效應(yīng)等需后續(xù)研究進一步證實。

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