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    甲拌磷殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒的研制

    2011-06-01 10:28:09魏松紅逄若霖紀(jì)明山谷祖敏祁之秋王英姿
    食品科學(xué) 2011年4期
    關(guān)鍵詞:丙酮緩沖液抗原

    魏松紅,逄若霖,王 翀,紀(jì)明山,谷祖敏,祁之秋,王英姿

    甲拌磷殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒的研制

    魏松紅,逄若霖,王 翀,紀(jì)明山,谷祖敏,祁之秋,王英姿

    (沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866)

    研制用于檢測甲拌磷殘留量的間接競爭ELISA試劑盒。甲拌磷包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度為4mg/L,抗體的最佳稀釋倍數(shù)為8000,甲拌磷多克隆抗體交叉反應(yīng)率小于20%,甲拌磷抑制率回歸曲線為y=18.846x+6.9949,在1~5000μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢測限為4.90μg/L,IC50為191.37μg/L。甲拌磷試劑盒的添加回收率均高于75%,供試樣品檢測結(jié)果的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于10%。試劑盒在4℃或-20℃下有效期為270d。

    甲拌磷;殘留;酶聯(lián)免疫吸附測定法;試劑盒

    甲拌磷[phorate,O,O-二乙基-S-(乙硫基甲基)二硫代磷酸酯]是有機(jī)磷類重要的內(nèi)吸性殺蟲殺螨劑,主要用于防治棉花、水稻、小麥、高粱等大田作物上的害蟲[1],為土壤和種子處理劑,高等毒性。甲拌磷在植物體內(nèi)氧化為更高毒性的氧化物,并有較長的殘效期,對人類的健康存在潛在威脅。因此,對甲拌磷殘留快速有效的檢測方法研究具有一定意義。目前,常見的甲拌磷檢測方法為氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法[2-3],由于常規(guī)儀器分析方法前處理步驟復(fù)雜,費時費力、設(shè)備昂貴,需要專業(yè)人員操作,不適宜大量樣品和現(xiàn)場快速檢測。以免疫化學(xué)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)檢測方法,具有快速、簡便、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點,適合大批量樣品的檢測[4]。Jeffre等[5]利用O,O-二乙基-O-[對-(4-羧基丁基)苯基]硫代磷酸酯作為半抗原制得廣譜特異性抗體,采用酶聯(lián)免疫方法對有機(jī)磷類殺蟲劑進(jìn)行檢測。劉賢進(jìn)等[6]采用二乙基膦酸乙酸做為通用結(jié)構(gòu)半抗原制備抗血清,對毒死蜱、辛硫磷等12種常見有機(jī)磷農(nóng)藥具有特異性,IC50為0.12~3.8μg/mL。本實驗在甲拌磷自主合成人工抗原及制備多克隆抗體的研究基礎(chǔ)上[7],研制甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒,并對其性能進(jìn)行測定,適用于土壤、糧食等樣品中甲拌磷殘留的分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    甲拌磷多克隆抗體 本實驗室制備;96孔酶標(biāo)版JET公司;五硫化二磷 河北世紀(jì)農(nóng)藥有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 中杉金橋有限公司;鄰苯二胺(OPD) 中國五聯(lián)化工廠;0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4);洗滌液:含體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液;0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6);封閉液:含5g/100mL胎牛血0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中定容;底物顯色液:10mg鄰苯二銨溶于25mL底物緩沖液中,加入10μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% H2O2混勻;終止液:2mol/L H2SO4溶液。

    Model 680酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 日本Eyela公司。

    1.2 方法

    1.2.1 抗原、抗體最佳工作濃度的確定

    用方陣試驗法對間接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作質(zhì)量濃度進(jìn)行選擇。0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋成不同質(zhì)量濃度后,包被酶標(biāo)板,每一種包被濃度設(shè)置不同的抗體質(zhì)量濃度。OD490nm為1.0左右,抗體抗原用量較少,即為抗體抗原工作質(zhì)量濃度[8]。

    1.2.2 丙酮溶劑對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響

    間接競爭ELISA法檢測過程中,加入甲拌磷多克隆抗體之前分別添加體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、20%和30%丙酮的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4),以不加丙酮為對照,每個處理3次重復(fù),計算抑制率,判斷丙酮含量對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響程度,確定丙酮含量。

    1.2.3 抗體的特異性檢測

    交叉反應(yīng)率是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力,反映了抗體的特異性。利用競爭性抑制試驗方法,分別測定抗體與甲拌磷及結(jié)構(gòu)類似物抑制率,以交叉反應(yīng)率高低比較抗體的特異性[9]。

    1.2.4 試劑盒內(nèi)容及操作方法

    試劑盒內(nèi)容:96孔酶標(biāo)板(甲拌磷包被抗原包被,2.5%胎牛血清封閉);甲拌磷多克隆抗體1瓶,1mL;酶標(biāo)二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG)1瓶,200μL;底物鄰苯二胺(OPD)1支,50mg;30%過氧化氫1瓶,每瓶2mL;反應(yīng)終止液1瓶,10mL;底物緩沖液1瓶,每瓶10mL;0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液1瓶,每瓶30mL;洗滌液1瓶,每瓶30mL,于-20℃下保存待用。

    操作方法:取出一塊包被有甲拌磷包被抗原且封閉好的酶標(biāo)板,恢復(fù)室溫后備用;加入50μL標(biāo)樣或處理好的樣品到各孔中;加入甲拌磷多克隆抗體,每孔50μL,37℃孵育1h;倒出孔中的液體,用100μL稀釋好的洗滌液洗3次;加入50μL稀釋的酶標(biāo)二抗,37℃孵育1h;倒出孔中的液體,用100μL洗滌液洗3次;加入底物顯色液100μL,并在37℃避光顯色30min;加入50μL反應(yīng)終止液,混合好后在490nm波長處測定OD值。

    1.2.5 試劑盒的結(jié)果判定

    配制1、10、50、100、200、500、1000、2000、5000μg/L的甲拌磷溶液,在加入甲拌磷多克隆抗體前分別添加到酶標(biāo)板中,每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次,分別以空白和不加甲拌磷溶液為對照,采用間接競爭ELISA法進(jìn)行檢測。以甲拌磷溶液質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),即得其標(biāo)準(zhǔn)曲線,由圖即可得其靈敏度。抑制率計算公式為:

    式中:ODmax為不加農(nóng)藥時的光密度;ODx為加農(nóng)藥時的光密度;ODmin為空白對照的光密度。

    1.2.6 試劑盒的回收率、精密度和有效期測定

    1.2.6.1 樣品的前處理

    將水稻植株、小麥植株樣品切碎,水稻種子、小麥種子、土壤樣品直接稱量,每份20g分別裝入三角瓶中。添加甲拌磷到樣品中,每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次。在樣品中加入90mL丙酮提取5min。提取液用布氏漏斗抽濾,用10mL丙酮沖洗濾渣,用二氯甲烷萃取,無水硫酸鈉進(jìn)行干燥后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮近干,丙酮定容至1mL,進(jìn)行ELISA分析[9]。

    1.2.6.2 加標(biāo)回收實驗

    分別取10、100、1000μg/kg的甲拌磷標(biāo)樣添加到樣品中,用間接競爭ELISA法測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出檢測的甲拌磷質(zhì)量濃度,計算添加回收率與變異系數(shù)。

    1.2.6.3 精密度實驗

    分別取10、100、1000μg/kg甲拌磷添加到樣品中,用間接競爭ELISA法測定其批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

    1.2.6.4 試劑盒有效期

    取同一批次試劑盒分別保存于4℃和-20℃,0、30、60、90、120、150、180、210、240、270d時,使用試劑盒測定添加到土壤中的甲拌磷,通過結(jié)果判斷試劑盒的有效性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抗原抗體的最佳工作質(zhì)量濃度

    表1 間接ELISA法中抗原、抗體最適工作質(zhì)量濃度方陣試驗結(jié)果Table 1 Optimal concentrations of antigen and antibody during indirect ELISA assay

    經(jīng)方陣實驗結(jié)果(表1),OD490nm為1.026時對應(yīng)的包被抗原和抗體的質(zhì)量濃度為最適工作質(zhì)量濃度,即甲拌磷包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度為4mg/L,抗體的最佳稀釋倍數(shù)為8000倍。

    2.2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響

    由表2可以看出,隨著丙酮比例加大,對顯色反應(yīng)的抑制逐漸增大,丙酮體積分?jǐn)?shù)5%時對抗原抗體結(jié)合能力影響最小,選定丙酮體積分?jǐn)?shù)為5%。

    表2 丙酮含量對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響Table 2 Effect of acetone concentration on conjugation between antigen and antibody

    2.3 抗體特異性檢測結(jié)果

    甲拌磷多克隆抗體對結(jié)構(gòu)類似的相關(guān)化合物進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗,結(jié)果表明該試劑盒與絕大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥沒有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng),與所測有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均小于20%(表3)。

    表3 抗甲拌磷抗體的特異性實驗Table 3 Specificity experiments of anti-phorate antibody

    2.4 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

    采用間接競爭ELISA法,以標(biāo)準(zhǔn)甲拌磷溶液質(zhì)量濃度對數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),即得其標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =18.846x+6.9949,甲拌磷質(zhì)量濃度在1~5000 μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.9401,最低檢測限為4.90μg/L,IC50為191.37μg/L。

    2.5 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

    用甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒測定5種不同的樣品的添加回收率(表4),結(jié)果表明添加回收率均高于75%,變異系數(shù)小于10%,說明本方法準(zhǔn)確可靠。

    表4 ELISA試劑盒測定樣品中甲拌磷添加回收率實驗結(jié)果Table 4 Recovery rate experimental results of samples spiked with phorate determined by ELISA kit

    2.6 精密度實驗結(jié)果

    用甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒測定5種不同樣品的添加量來衡量其精密度(表5),結(jié)果表明試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)在4.18%~7.81%之間,小于8%,批間變異系數(shù)在6.17%~8.39%之間,小于9%,說明該試劑盒精密度很好。

    表5 ELISA試劑盒測定樣品中甲拌磷的精密度實驗結(jié)果Table 5 Precision experimental results of phorate determination in samples by ELISA kit

    2.7 試劑盒有效期實驗結(jié)果

    表6 抗體有效期實驗結(jié)果Table 6 Experimental results of valid period of ELISA kit

    經(jīng)甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒測定土壤中添加樣品含量,結(jié)果表明試劑盒在4℃和-20℃條件下保存至270d有效(表6)。

    3 結(jié) 論

    本研究在自主合成甲拌磷半抗原,并免疫制得甲拌磷多克隆抗體的基礎(chǔ)上[7],研制了一種適用于檢測樣品中甲拌磷殘留的間接競爭ELISA試劑盒,并對試劑盒的靈敏度、特異性、精密度、準(zhǔn)確度和有效期進(jìn)行測定。研制的試劑盒檢測限為4.90μg/L,IC50為191.37μg/L,線性檢測范圍1~5000μg/L,交叉反應(yīng)率小于20%,供試樣品檢測結(jié)果的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于10%,回收率均高于75%,試劑盒在4℃或-20℃下至少可保存270d,試劑盒穩(wěn)定性較好。目前,甲拌磷在糧食作物上不允許殘留,本研究研制的試劑盒可通過加強(qiáng)免疫,提高抗血清的效價,進(jìn)一步提高靈敏度,使其更好地應(yīng)用到環(huán)境及食品中的甲拌磷殘留檢測。

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    Development of Indirect ELISA Kit for Detecting Phorate Residue

    WEI Song-hong,PANG Ruo-lin,WANG Chong,JI Ming-shan,GU Zu-min, QI Zhi-qiu,WANG Ying-zi
    (College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

    An indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)kit was developed to monitor phorate residue. The optimal concentration of coating antigen was 4 mg/L and the optimal dilution ratio of antibody was 8000. The cross-reaction ratio was less than 20%. The regression equation of inhibition rate for phorate was y = 18.846x+6.9949 with a linear detection range of 1-5000μg/L. Results indicated that the detection limit was 4.90μg/L and IC50was 191.37μg/L. The recovery rates were higher than 75%. The intra-assay and inter-assay coefficients were less than 10%. The developed kit can be stored at 4℃ or -20 ℃ for 270 days.

    phorate;residue;enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);kit

    S482.4

    B

    1002-6630(2011)04-0284-04

    2010-04-14

    沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)中、青年碩士生導(dǎo)師資助項目

    魏松紅(1974—),女,副教授,博士,研究方向為農(nóng)藥學(xué)。E-mail:songhongw125@163.com

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