超高效液相色譜法同時(shí)測定飲料中5種人工合成色素

張 婉，王 覃，杜 寧，周 悅，李津廷，張經(jīng)華*

(北京市理化分析測試中心，北京 100089)

超高效液相色譜法同時(shí)測定飲料中5種人工合成色素

張 婉，王 覃，杜 寧，周 悅，李津廷，張經(jīng)華*

(北京市理化分析測試中心，北京 100089)

目的：建立超高效液相色譜同時(shí)測定飲料中5種人工合成色素(檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán))的檢測方法。方法：樣品采用聚酰胺吸附法提取色素，通過Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18反相色譜柱分離，以甲醇-0.02mol/L乙酸銨緩沖溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，于254nm和629nm波長處檢測。結(jié)果：5種人工合成色素在5.5min內(nèi)完成分離，3～80mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r＞0.9995)，檢出限為0.03～0.10mg/L，平均回收率為97.4%～107.3%，RSD為0.22%～3.20%。結(jié)論：該方法簡便、快速、分離效果好、靈敏度高，適用于飲料中人工合成色素的測定。

超高效液相色譜法；人工合成色素；飲料

食品著色劑分為天然色素和人工合成色素，其中，人工合成色素由于具有色澤艷麗、性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強(qiáng)、配色方便和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在食品生產(chǎn)、加工行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。但是，人工合成色素主要是以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、硝化、鹵化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)制成的，有的還含有β-萘胺和α-氨基萘酚等致癌物，過多食用會(huì)危害人體健康。因此，食品中人工合成色素有著嚴(yán)格的控制使用范圍和最大使用量，其測定具有重要意義。

目前，人工合成色素的檢測方法有薄層色譜法[1]、高效液相色譜法[1-2]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-4]、極譜法[1]、光度法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]。對于多組分合成色素混合物的分析，薄層色譜法操作繁瑣，且定量準(zhǔn)確度較差；液相色譜法是目前應(yīng)用最為普遍的分析方法；色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖然在分辨率和靈敏度方面有一定優(yōu)勢，但其儀器昂貴，推廣應(yīng)用受到一定限制；極譜法受干擾因素影響較多，定性較為困難；光度法需要結(jié)合一些化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，數(shù)據(jù)處理較為復(fù)雜；毛細(xì)管電泳法則重現(xiàn)性較差。而超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)技術(shù)與傳統(tǒng)的液相色譜(HPLC)技術(shù)相比，大幅度改善了分析速度、分離度、樣品通量和靈敏度，該技術(shù)目前已在食品安全、環(huán)境分析、藥物開發(fā)等領(lǐng)域得到應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在建立UPLC同時(shí)測定飲料中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和亮藍(lán)5種人工合成色素的分析方法，并探討本方法與HPLC法、毛細(xì)管電泳法相比的優(yōu)勢，以期為人工色素的分析方法的確定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

5種飲料樣品購自市場，分別為橙味飲料(1#)、維生素功能飲料(2#)、葡萄汁飲料(3#)、橙味汽水(4#)、運(yùn)動(dòng)飲料(5#)。

檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅和亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品(GBW(E)100001a～5a) 中國計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

ACQUITYTM超高效液相色譜儀[配有高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(PDA)、Empower色譜工作站] 美國Waters公司；Milli Q純水儀 美國Millipore公司；CP224S電子天平 瑞士Metteler Toledo公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.02mol/L乙酸銨(B)梯度洗脫；流速：0.25mL/min；樣品室溫度：25℃；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2.5μL；檢測波長：254nm和629nm；檢測器采樣速率：20點(diǎn)/s。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將質(zhì)量濃度0.5g/L的色素單標(biāo)溶液，根據(jù)需要混合，并用超純水稀釋成質(zhì)量濃度分別為3.0、5.0、10.0、20.0、50.0、80.0mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，進(jìn)行UPLC測定。

1.4 樣品的制備

稱取飲料試樣15g，置于100mL燒杯中，對碳酸飲料樣品加熱驅(qū)除二氧化碳。加20g/100mL檸檬酸調(diào)節(jié)試樣pH值到6，加熱至60℃，加入1g聚酰胺粉，充分?jǐn)噭颍訥3垂融漏斗抽濾，用60℃ pH4的去離子水洗滌3次(10mL/次)，然后用甲醇-甲酸(6:4)溶液洗滌3次(10mL/次)，再用水洗滌至中性，用無水乙醇-氨水-水(7:2:1)溶液解吸3～5次(10mL/次)，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至10mL。定容后的樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，進(jìn)行UPLC測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 梯度洗脫條件的選擇

采用甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液體系作為流動(dòng)相，考察不同配比下5種色素的分離情況。結(jié)果表明：采用梯度洗脫的方式，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃很容易實(shí)現(xiàn)基線分離，而亮藍(lán)存在同分異構(gòu)體，若梯度變化過快，3種異構(gòu)體的色譜峰不能分離。因此，在前4種色素得到良好分離后，進(jìn)行1.5min的等度洗脫，然后再加大甲醇的洗脫體積分?jǐn)?shù)，使亮藍(lán)的3種同分異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)基線分離。方法選用的梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

2.1.2 檢測波長的選擇

5種人工合成色素均為水溶性酸性染料，結(jié)構(gòu)中含有數(shù)量不等的苯磺酸基，在紫外區(qū)有較強(qiáng)的特征吸收。因此，國家標(biāo)準(zhǔn)方法和大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法選用254nm作為以上5種人工合成色素的檢測波長。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：亮藍(lán)在254nm波長處的靈敏度很低，難以滿足實(shí)際檢測需要。所以，本實(shí)驗(yàn)采用PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描(掃描范圍210～700nm)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以上5種人工合成色素除了在紫外區(qū)有著較強(qiáng)特征吸收外，由于各種色素的結(jié)構(gòu)中含有不同的發(fā)色及助色基團(tuán)，在可見光區(qū)也有最大吸收波長。5種色素最大吸收波長分別為檸檬黃：257.4、427.1nm；莧菜紅217.2、521.8nm；胭脂紅216.0、508.4nm；日落黃234.9、484.1nm；亮藍(lán)307.4、628.2nm。由此選擇254nm作為檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃4種人工合成色素的檢測波長，629nm作為亮藍(lán)的檢測波長。在相應(yīng)的檢測波長下，5種人工合成色素響應(yīng)值高，背景干擾小。

2.1.3 柱溫的選擇

實(shí)驗(yàn)考察25、30、35℃柱溫條件下5種人工合成色素的分離效果，結(jié)果表明：對于色譜柱溫的改變，各組分的保留時(shí)間和靈敏度變化不明顯，但隨著柱溫的增加柱壓有所降低，因此，實(shí)驗(yàn)選用30℃作為分析的柱溫條件，既接近常溫，又有較小的柱壓。

2.1.4 流速的選擇

流速大小會(huì)影響柱壓、洗脫時(shí)間和分離度。實(shí)驗(yàn)考察0.25、0.35、0.50mL/min 三種流速下5種人工合成色素的分離效果，結(jié)果表明：隨著流速的增加，分析時(shí)間相應(yīng)縮短，在0.5mL/min流速時(shí)，4.0min內(nèi)可完成分離。但是，在該條件下，柱壓有所升高，色譜峰變寬，柱效降低，且綜合考慮檢測大量樣品時(shí)溶劑的消耗量，本實(shí)驗(yàn)選擇0.25mL/min為最佳流速。在最佳色譜條件下，對標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際樣品進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。

圖1 5種人工合成色素標(biāo)準(zhǔn)品(a)和1#飲料樣品(b)色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed five pigment standards and beverage sample No. 1

2.2 線性關(guān)系及檢出限

將一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣分析，在3～80mg/L(n=6)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各人工合成色素組分均與其各自對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系(r＞0.9995)。各色素的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(RSN=3)見表2。

表2 5種人工合成色素的保留時(shí)間、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Retention times, linear equations, correlation coefficients and detection limits of five synthetic pigments

2.3 精密度和穩(wěn)定性

以一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次日內(nèi)和5次日間測定，分別對5種色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作定性(保留時(shí)間)、定量(峰面積)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明：5種人工合成色素保留時(shí)間的日內(nèi)RSD＜0.4%、日間RSD＜0.7%；峰面積的日內(nèi)RSD＜0.5%、日間RSD＜2.7%，顯示該儀器方法的定性定量精密度和穩(wěn)定性均能滿足分析要求。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

稱取等量已測定本底值的1#飲料樣品6份，分別按5.00mg/L和30.00mg/L 2個(gè)添加水平加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平3份，按1.4節(jié)方法制成待測溶液后進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明：5種人工色素的回收率為97.4%～107.3%，RSD為0.22%～3.20%。實(shí)際加標(biāo)樣品的色譜圖見圖2。

圖2 1#飲料加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of spiked beverage sample No. 1

2.5 檢測方法應(yīng)用

對市售的5種飲料樣品進(jìn)行測定，根據(jù)各化合物峰的保留時(shí)間和吸收光譜進(jìn)行定性，外標(biāo)峰面積法定量，結(jié)果見表3。

表3 飲料樣品檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Pigment contents in beverage samples determined by this method

我國GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[7]規(guī)定：食品中檸檬黃和胭脂紅的最大使用限量為0.05g/kg，莧菜紅、日落黃、亮藍(lán)為0.025g/kg，通過實(shí)驗(yàn)檢測出4個(gè)飲料樣品中含有的5種人工合成色素均未超出國家標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC法具有以下特點(diǎn)：首先是分析速度快，分離5種人工合成色素僅需5.5min；而文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法[2]需時(shí)12min，毛細(xì)管電泳法[6]需時(shí)15min。其次，對于5種人工合成色素分離效果好。由于采用小顆粒填充的短柱，因此具有較高的柱效和較低擴(kuò)散體積。實(shí)驗(yàn)采用了梯度洗脫程序，使得檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃及亮藍(lán)的3種同分異構(gòu)體都實(shí)現(xiàn)了良好的基線分離。此外，靈敏度有明顯提高。使用PDA雙通道波長檢測，各色素特別是亮藍(lán)的檢測靈敏度有了較大提高，5種色素的檢出限為0.03～0.10mg/L，而HPLC法為0.30～1.40mg/L，毛細(xì)管電泳法為0.02～0.18mg/L。最后，UPLC法節(jié)省溶劑。由于分析時(shí)間和流動(dòng)相流速的區(qū)別，本法分析一次樣品所消耗的溶劑量僅為1.62mL，而HPLC法需8.40mL。

本實(shí)驗(yàn)建立的使用UPLC同時(shí)檢測飲料中人工合成色素的方法，快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏，適用于實(shí)際飲料樣品的檢測工作。

[1] GB/T 5009.35—2003 食品中合成著色劑的測定[S].

[2] 王春榮, 張濟(jì), 劉嵐錚. 食品中多種合成色素的反相高效液相色譜法測定[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2005, 21(3): 359-360.

[3] 陳曉紅, 李小平, 姚潯平. 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定飲料中人工合成色素的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2005, 15(8): 941-942.

[4] 李幫銳, 馮家力, 潘振球, 等. 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定飲料中的人工合成色素[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2007, 17(4): 579-581.

[5] 賈燕, 張克榮, 鄭波. 偏最小二乘法-分光光度法同時(shí)測定多種食用合成色素[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 30(2): 260-262.

[6] 趙新穎, 賈麗, 周曉晶, 等. 毛細(xì)管電泳同時(shí)測定糖果中5種人工合成色素的含量[J]. 現(xiàn)代儀器, 2008(4): 58-60.

[7] GB 2760—2007 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

Determination of Five Synthetic Pigments in Beverage by Ultra Performance Liquid Chromatography

ZHANG Wan，WANG Tan，DU Ning，ZHOU Yue，LI Jin-ting，ZHANG Jing-hua*
(Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

Objective: To develop an ultra performance liquid chromatography (UPLC) method for the determination of five synthetic pigments such as tatrazine, amaranth, carmine, sunset yellow and brilliant blue in beverage. Methods: Synthetic pigments in beverage were extracted by polyamide adsorption method, separated on a Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 column by gradient elution using a mobile phase made up of methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate, and detected at 254 nm and 629 nm. Results: The five synthetic pigments were separated in 5.5 min. The UPLC method exhibited excellent linearity over a range of 3－80 mg/L (r ＞ 0.9995). The detection limit, recovery rate and relative standard deviation (RSD) of this method were 0.03－0.10 mg/L, 97.4%－107.3%, and 0.22%－3.20%, respectively. Conclusion: The analytical method is simple, accurate,sensitive and suitable for the determination of pigments in beverage.

ultra performance liquid chromatography；synthetic pigment；beverage

O657. 63

A

1002-6630(2011)04-0177-04

2010-04-14

北京市科學(xué)技術(shù)研究院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IG200801N/C2)

張婉(1984—)，女，實(shí)習(xí)研究員，碩士，主要從事理化檢驗(yàn)研究。E-mail：wanzhang@yahoo.cn

*通信作者：張經(jīng)華(1958—)，男，研究員，博士，主要從事分析化學(xué)及天然產(chǎn)物分離提純研究。E-mail：z_j_h2006@yahoo.com.cn