豬戊型肝炎病毒雙重RT-PCR檢測診斷方法的建立及其應(yīng)用

郝寶成,蘭 喜,胡永浩,柳紀(jì)省,,梁劍平,

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新獸藥工程重點開放實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室,甘肅蘭州730050;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅蘭州730046;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

豬戊型肝炎(HE)是近年來頗受人們關(guān)注的一種人畜共患傳染病。人普遍易感。急性戊型肝炎病情較重,病死率為2.5%,明顯高于甲型(0.1%)和乙型(0.9%)肝炎,孕期婦女死亡率可高達15%～20%[1],尤其是懷孕最后3個月的孕婦病死率更高。1986～1988年我國新疆南部地區(qū)曾發(fā)生HE水源性大流行,共計有119 280人發(fā)病,死亡707人,是迄今世界上最大、最嚴重的一次戊型肝炎流行[2]。

豬作為HEV的貯存宿主,在人類病毒性肝炎的流行病學(xué)中具有重要的地位,對于公共衛(wèi)生、異種器官移植和食品安全等構(gòu)成潛在的威脅[3]。因此,在加強對豬戊型肝炎的預(yù)防控制方面,快速準(zhǔn)確的檢測和注射疫苗將是最為有效的防控手段。目前,對于病毒性疫病的診斷一般采用病原分離鑒定和血清學(xué)方法 ,但這些方法存在操作繁雜、費時費力、敏感性較差等不足,特別是當(dāng)動物感染多種病原時,難以應(yīng)用常規(guī)方法進行早期快速檢測。由于目前商業(yè)化的HEV抗體診斷試劑以Ⅰ型HEV抗原為主,在臨床檢測中可能存在不同基因型樣品的漏檢現(xiàn)象,所以有必要針對不同基因型建立有效﹑快速的檢測診斷方法。

1 材料與方法

1.1 病毒 病料1～217號為豬糞便樣品,218～255號為豬膽汁血清樣品,采集自甘肅省不同地區(qū)豬養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑 病毒RNA小量制備試劑盒購自QIAGEN公司;T反應(yīng)試劑盒 、TaKaRa TaqTM、100 bp DNA Marker 、λ-EcoT14、質(zhì)粒抽提試劑盒 、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SphⅠ購自Promega公司;E.coli DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室保存。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank收錄的 HEV ORF2基因序列,參照設(shè)計1對特異性引物,引物由TaKaRa公司合成。其序列為:E01:5′-TGGCGTTCG(A/T)GTTGAGA-3′;E02:5′-GGT(C/G)GTC(G/T)GCT(G)GAGGAGGAG-3′;E03:5′-CCGACQAAATCAAT TCTGTC-3′;E04:5′-T TG(A)TCCTGCTGA(T)GCG(A)T TCTC-3′

1.4 病毒RNA的提取 依次取病料樣懸液1～255號,10 000 r/min離心3 min,取上清液,病毒RNA小量制備試劑盒抽提病毒RNA。上述步驟均在BPL3實驗室進行。

1.5 cDNA的合成 在0.2 mL EP管中依次加入5 ×RT Buffer 4 μ L,RNase Free ddH2O 3.5 μ L,dNTP Mixture(各 10 mmol/L)1 μ L,RNase inhibitor 1 μ L,AMV Rverse Tran-scriptase 0.5 μ L(5 U/μ L),RNA 樣品 10 μ L,反應(yīng)總體積為 20 μ L。反轉(zhuǎn)錄條件:42℃60 min,70℃15 min。

1.6 PCR擴增 反轉(zhuǎn)錄液3 μ L,10×PCR緩沖液2.5 μ L,25 mmol/L MgCl22 μ L,用 10 mmol/L dNTPs 1 μ L,2 個外引物各 0.5 μ L(20 pmol/μ L),Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)0.25 μ L,ddH2O 調(diào)整終體積至50 μ L。取第一輪PCR 產(chǎn)物1 μ L,2個內(nèi)引物各0.5 μ L(20 pmol/μ L),其余成分與第一輪PCR反應(yīng)相同,進行第二輪PCR反應(yīng)。按反應(yīng)程序 :94℃、2 min;94 ℃、30 s,50℃、30 s,72℃、2 min 30 s,共35個循環(huán);72℃延伸15 min,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳觀察(見圖1、圖2)。擴增后未獲得產(chǎn)物的樣品,在進行套擴以后仍沒有獲得目的條帶大小的樣品的同時,調(diào)整擴增條件再次確認。對于擴增所得條帶與目的條帶大小可疑的樣品繼續(xù)進行下一步克隆鑒定。

1.7 cDNA克隆與鑒定 PCR產(chǎn)物按小量膠回收試劑盒回收,與 pMD20-T載體連接(體系:pMD20-T 1μ L,Ligation solution I 5.0 μ L 、DNA樣品4.0 μ L)輕輕混勻后,16℃連接過夜,連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含Amp、X-Gal及IPTG的鑒別培養(yǎng)基,挑取藍斑作陰性對照提取質(zhì)粒初選陽性菌落培養(yǎng),用質(zhì)粒PCR以及用BamHⅠ+SphⅠ進行酶切鑒定,酶切體系為:BamH Ⅰ1.0 μ L 、Sph Ⅰ1.0 μ L 、質(zhì)粒 DNA 16 μ L 、10 ×K Buffer 2.0 μ L 、總體積 20.0 μ L,37 ℃水浴酶切5 h,以1%瓊脂糖電泳分析酶切結(jié)果。鑒定的重組質(zhì)粒依次命名為pMD-1～pMD-x。

1.8 序列測定和比較分析 將陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將所測序列登陸GenBank,確定是否為豬戊型肝炎病毒陽性。

2 結(jié)果

對所采集的255份樣品,經(jīng) RT-PCR檢測,共有豬戊型肝炎病毒陽性12份,陽性率為4.71%。表明甘肅省養(yǎng)殖豬中存在豬戊型肝炎病毒的感染,見圖1、圖2及表1。

表1 255份疑似豬戊型肝炎病毒樣品RT-PCR檢測結(jié)果統(tǒng)計

在鑒定樣品中,豬糞樣21,39,54,73,79,80,126,136,189號樣為陽性樣品,豬膽汁血清樣中219,226,227號樣為陽性樣品。

3 討論

戊型肝炎主要通過糞便污染途徑傳播,近年來隨著對戊型肝炎研究的深入,發(fā)現(xiàn)還通過母嬰傳播。Khuroo[4]等報道了新生兒由于母嬰傳播而感染的案例,感染率為78.9%。另外研究表明,HEV不僅感染人,而且可以感染豬、野豬、雞、鳥[5]、鼠[6]、貓[7-8]及鹿等動物,人也可以通過生吃鹿肉而染病[9-10],提示人畜是HEV的共同宿主。

HEV基因有 3個開放閱讀框(open reading frames,ORFs),ORF2為主要的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū),長約2kb,其被認為是最保守的區(qū)域,其核苷酸序列也最保守。本文利用DNAMan軟件對GenBank登錄的戊型肝炎病毒4個主要基因型代表株的序列進行分析,選擇其高度保守的ORF2區(qū)域設(shè)計合成套式引物,對在甘肅地區(qū)采集的255份豬糞便或豬膽汁血清樣品,進行了檢測診斷。試驗共檢驗255份豬糞便或豬膽汁血清樣品,檢出陽性數(shù)為12份,陽性率為4.71%。其中豬糞便樣﹑豬膽汁血清樣陽性率分別為4.15%﹑7.89%,本次檢測診斷結(jié)果表明,在甘肅省的養(yǎng)殖場豬群中存在豬戊型肝炎的感染。樣品采集為隨機采樣,檢出陽性樣品后在同一豬群中按量采樣,上表中所列的陽性率與報道的流行率7%～15%比較接近,可以作為一個HEV流行率研究的參考。

目前,國內(nèi)外專家學(xué)者已對豬戊型肝炎的病原學(xué)、流行病學(xué)、實驗室診斷、基因結(jié)構(gòu)等方面研究取得了重大進展。但對豬戊型肝炎的發(fā)病機理尚需進一步的研究。對其發(fā)病機理的研究,是進一步開發(fā)診斷試劑盒和建立有效預(yù)防控制機制的基礎(chǔ)。

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[10]郝寶成,蘭喜,柳紀(jì)省,等.豬戊型肝炎病毒 swCH-GS189株ORF2基因的克隆及序列分析[J].生物技術(shù)通報,2009,5:122-126.