貓病毒性鼻氣管炎PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

屈 哲,徐鑌蕊,睢艷平,王 勇,杜 艷

(1.中國藥品生物制品檢定所,北京東城100050;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193)

貓病毒性鼻氣管炎(FR)又稱貓皰疹病毒Ⅰ型(FHV-1)可引起貓的上呼吸道感染,是一種貓的常見的急性、高度接觸性上呼吸道疾病[1-2]。病貓精神沉郁,打噴嚏,食欲下降,結(jié)膜炎,漿液性的眼鼻分泌物,體溫升高,深部的氣管咳嗽[3]。慢性感染病例舌頭和上頷出現(xiàn)潰瘍。FHV-1只感染貓及貓科動物,主要侵害幼貓,發(fā)病率達(dá) 100%[4],死亡率約為50%[5]。若懷孕貓感染,可造成流產(chǎn)[6]。

貓鼻氣管炎病毒(FRV)是1958年Crandell等首次從美國分離[7]。隨后相繼發(fā)現(xiàn)于加拿大、英國、荷蘭等地。目前,我國FHV-1發(fā)病率呈上升趨勢,多次發(fā)現(xiàn)臨床可疑病例。但獸醫(yī)臨床還只依靠傳統(tǒng)的診斷方法,診斷結(jié)果不準(zhǔn)確,實(shí)驗(yàn)室診斷也主要依靠病毒分離和血清學(xué)方法[8],過程費(fèi)時、費(fèi)力。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)具有敏感、特異、快速的優(yōu)點(diǎn)[9],特異性PCR檢測方法的建立,對預(yù)防,治療及根除FHV-1有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料 貓皰疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、貓細(xì)小病毒(FPV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV),均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。試劑 Taq DNA聚合酶,Marker-DL-2 000,PEASY-T1載體和March1-T1菌液(北京全式金生物技術(shù)有限公司),dNTPs,Buffer(MgCl2),隨機(jī)引物(北京優(yōu)博基因科技有限公司提供合成)。

1.2 引物 根據(jù)GenBank中注冊的FHV-1-TK基因,借助 Primer Premier5.0軟件,設(shè)計針對FHV-1TK基因部分片段的引物:P1 5′-CGCTTGAGGACAGCATAA-3′,P2 5′-TGGGAAACAGACCAGA GA-3′,由北京優(yōu)博基因科技有限公司合成。

1.3 提取DNA 含有病毒的分泌物溶于滅菌生理鹽水,離心棄上層液體后加入裂解液和蛋白酶 K 56℃水浴消化2 h以上,用 Tris飽和酚和酚∶氯仿∶異戊醇(體積比為25∶24∶1)除蛋白質(zhì)。無水乙醇和3 mol/L醋酸鉀沉淀DNA。離心棄上清,干燥后加入滅菌雙蒸水制成樣品待用。

1.4 PCR 擴(kuò)增 20 μ L 反應(yīng)體系 :樣品 2 μ L,上下游引物 1 μ L,dNT Ps 2 μ L,10 ×Buffer(MgCl22 μ L,Taq DNA聚合酶0.3 μ L,滅菌雙蒸水加至 20 μ L。PCR程序:94℃3 min,94℃1 min,52℃45s,72℃45s,30個循環(huán)后72℃作用10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取3 μ L PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.5 敏感性試驗(yàn) 從眼分泌物中提取的病毒DNA在紫外分光光度計上測定濃度,20 μ L體系中含DNA 量約為 3 μ g,按 10-1至 10-6作 10倍連續(xù)稀釋,再作為模板加入該P(yáng)CR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6 特異性試驗(yàn) 從FHV-1、FPV、FIPV的病毒保存液中提取病毒DNA,加入該P(yáng)CR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,檢測該方法的特異性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 用該方法重復(fù)3次各檢測8份FHV-1陽性樣品和2份陰性樣品,比較其重復(fù)性。

1.8 PCR產(chǎn)物測序 將1.2.4中得到的PCR產(chǎn)物回收純化后連接到PEASY-T1載體上并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞March1-T1,篩選出4個可疑重組質(zhì)粒菌落做PCR擴(kuò)增均得到目的片段,送往Invitrogen公司進(jìn)行測序。

1.9 臨床病例檢測 取28例臨床可疑病例的貓眼鼻拭子,用該P(yáng)CR方法進(jìn)行檢測并統(tǒng)計出檢測的陽性率。

2 結(jié)果

2.1 敏感性試驗(yàn) PCR結(jié)果表明,該引物能檢測出的最低FHV-1 DNA量約為300 pg(圖1)。

圖1 FHV-1 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn) 將FHV-1、FPV、FIPV和陰性分泌液中提取的DNA PCR擴(kuò)增后只有FHV-1毒株可擴(kuò)增出特異性條帶,片段長度約537 bp。與預(yù)計的片段長度相符合。而其他毒株和陰性分泌液均未出現(xiàn)特異性條帶(圖2)。

圖2 FHV-1 PCR特異性檢測結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 用該方法重復(fù)3次檢測8份陽性FHV-1樣品,結(jié)果3次試驗(yàn)中8份陽性樣品均擴(kuò)增出特異性片段,說明該方法具有可重復(fù)性。

2.4 產(chǎn)物序列分析 將PCR產(chǎn)物序列測定結(jié)果與GenBank上收錄的所有FHV-1TK基因部分序列作同源性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)同源性達(dá)100%。證明PCR擴(kuò)增片段屬FHV-1的特異性片段。

2.5 臨床病例檢測結(jié)果 將28個臨床可疑病例分為4組,應(yīng)用上述該P(yáng)CR方法進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果?？偣灿?5例檢測出FHV-1陽性,陽性率約為89.3%。

3 討論

近幾年,在我國臨床上貓病毒性鼻氣管炎的發(fā)病率迅速上升,而檢測FHV-1卻主要依靠臨床表現(xiàn)及發(fā)病史進(jìn)行診斷,其診斷結(jié)果不確實(shí),實(shí)驗(yàn)室診斷也只停留在病毒分離和血清學(xué)診斷,但其操作繁瑣、診斷時間長、結(jié)果重復(fù)性不好等。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)首次根據(jù)GenBank中注冊的FHV-1 TK基因序列,設(shè)計1對針對FHV-1的特異性引物,并不斷摸索優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)程序,建立了一種快速、敏感、特異性強(qiáng)的FHV-1 PCR檢測方法。

FHV-1的TK基因是FHV-1的特異性基因序列,通過PCR方法擴(kuò)增TK基因部分序列可以用于確診FHV-1。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示537 bp處出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶,其測序結(jié)果與已注冊的FHV-1 TK基因部分序列同源性100%,而FPV和FIPV以及陰性分泌液均未擴(kuò)增出特異性片段,因此,此PCR方法具有較高的特異性。本試驗(yàn)建立的PCR檢測方法的敏感性試驗(yàn)?zāi)軝z測出的最低DNA量約為300 pg,靈敏度較高。

本研究建立的FHV-1 PCR檢測方法可通過采集病貓的眼鼻分泌物對臨床出現(xiàn)的可疑病例進(jìn)行檢測,其檢測過程快速簡便,檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高。本實(shí)驗(yàn)室已將該檢測方法應(yīng)用于臨床檢測,檢出的陽性率較高。本方法的建立使本試驗(yàn)室分離、純化以及保存了貓皰疹病毒,為今后研究皰疹病毒及疫苗的開發(fā)打下基礎(chǔ),對我國現(xiàn)今發(fā)病率迅速上升的貓病毒性鼻氣管炎的防治有重要意義。

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