神農(nóng)香菊全草特征指紋圖譜研究

詹曉蓮，盧金清

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430061)

神農(nóng)香菊全草為菊科植物神農(nóng)香菊［Dendranthema indicum(L.)Des Mon1.var.aromaticum Q.H．Liu et S.F.Zhang］的全草［1］。神農(nóng)香菊藥用部位為其干燥頭狀花序，該藥具有疏風(fēng)清熱、平肝明目、散風(fēng)降壓的功效［2］，主要化學(xué)成分為黃酮類化合物［3］。筆者未見神農(nóng)香菊全草化學(xué)成分特征圖譜研究的文獻(xiàn)。近年來，隨著神農(nóng)香菊的不斷開發(fā)，需求量急劇增加，導(dǎo)致采挖神農(nóng)香菊現(xiàn)象嚴(yán)重，野生資源遭到嚴(yán)重破壞。神農(nóng)香菊人工種植又面臨生長條件要求高，不能在平原地區(qū)大面積種植等困難。為了擴(kuò)大神農(nóng)香菊的藥用部位，提高其藥用價(jià)值，筆者對(duì)神農(nóng)香菊全草部位的指紋圖譜等進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法建立了神農(nóng)香菊全草的特征圖譜。經(jīng)過系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)和方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)神農(nóng)香菊全草的特征圖譜具有系統(tǒng)性、全面性和特征性，可以有效地鑒別神農(nóng)香菊全草及其原藥材，為全面評(píng)價(jià)和控制神農(nóng)香菊的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex-Ultimate 3000液相色譜儀，Starsorius BSI型電子分析天平(d=0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司)，UP520H超聲波清洗機(jī)(熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司)，Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

1.2 試藥 甲醇為色譜純(美國天地公司，批號(hào):100019-200703)，磷酸(上海振興化工一廠，分析醇，批號(hào):112041-200611)，磷酸二氫鉀(上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司，批號(hào):100745-200701)，水為雙蒸水，木犀草素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):111520-200201)，神農(nóng)香菊［由湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳科力教授鑒定為Dendranthema indicum(L.)Des Mon1.var.aromaticum Q.H.Liu et S.F.Zhang，共 10 個(gè)樣品，見表1］。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.5)為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫;流速:0.5 mL·min-1;檢測(cè)波長 350 nm;柱溫:35℃，理論塔板數(shù)按木犀草素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

表1 不同來源的神農(nóng)香菊全草樣品

表2 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 試液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含1.0 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 本品粉末過篩孔內(nèi)徑840 μm 篩(二號(hào)篩)，取1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察及相似度計(jì)算

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取1號(hào)供試品溶液5 μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，以木犀草素峰(峰7)作為參照峰，指定其α值為1.000，考察儀器精密度，各特征指紋峰相對(duì)保留時(shí)間和特征指紋峰相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.3%～1.0%和1.1%～2.8%之間，均＜3%，符合指紋圖譜的要求。

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取3號(hào)供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0，3，6，9，12，24 h 進(jìn)行檢測(cè)，以木犀草素峰為參照，指定其α值為1.000，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，各特征指紋峰相對(duì)保留時(shí)間和特征指紋峰相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.2%～0.9%和1.1%～2.8%之間，均＜3%，符合指紋圖譜的要求。

2.3.3 重復(fù)性研究 取本品5號(hào)粉末［過篩孔內(nèi)徑為(850±29)μm 篩］5份，每份1.0 g，精密稱定，照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以木犀草素峰為參照，指定其α值為1.000，考察方法的重復(fù)性，各特征指紋峰相對(duì)保留時(shí)間和特征指紋峰相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.2% ～0.9%和1.3% ～2.9%之間，均＜3%，符合指紋圖譜的要求。

2.4 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù) 取樣品粉末［過篩孔內(nèi)徑(850±29)μm］10批，每份1.0 g，照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。選定木犀草素峰作為參照，指定的α值為1.000，特征指紋峰相對(duì)保留時(shí)間和特征指紋峰相對(duì)峰面積的結(jié)果見表3，4。

表3 神農(nóng)香菊全草共有特征指紋峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 神農(nóng)香菊全草共有特征指紋相對(duì)峰峰面積

通過對(duì)10批神農(nóng)香菊藥材全草指紋圖譜的HPLC-FPS和不同樣品間HPLC-FPS的比較，建立神農(nóng)香菊藥材對(duì)照指紋圖譜，各樣品指紋圖譜特征峰與對(duì)照指紋圖譜特征峰有良好的重復(fù)性，神農(nóng)香菊全草指紋圖譜應(yīng)有10個(gè)特征峰。見圖1。

圖1 神農(nóng)香菊全草對(duì)照藥材指紋圖譜7.木犀草素

2.5 相似度計(jì)算 根據(jù)國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2004A版，筆者計(jì)算了神農(nóng)香菊10批藥材全草的相似度，結(jié)果分別為0.972，0.987，0.965，0.972，0.957，0.966，0.979，0.986，0.952，0.990。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，選擇用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，曾使用過 Diamasil(200 mm ×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×3.0mm，5 μm)、TURNER KromasilTM(4.6 mm×250 mm，5 μm)及 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，最后根據(jù)色譜峰的分離效果及穩(wěn)定性等因素綜合考慮，選擇使用 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

3.2 流動(dòng)相的選擇 筆者曾使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸作為流動(dòng)相進(jìn)行等度及梯度洗脫，結(jié)果木犀草素的色譜峰對(duì)稱性差且各色譜峰分離度不好，最后根據(jù)分離情況和色譜峰的對(duì)稱性選擇以磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.5)為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫效果最佳。

3.3 10批藥材全草指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 10批不同產(chǎn)地神農(nóng)香菊全草樣品的指紋圖譜面貌基本一致，由各產(chǎn)地神農(nóng)香菊全草指紋圖譜相似度良好(r＞0.90)，反映了藥材的同源性，可以用來作定性鑒別。

本方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可為神農(nóng)香菊全草及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定提供參考依據(jù)，為神農(nóng)香菊物質(zhì)基礎(chǔ)研究與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?？梢杂行У罔b別神農(nóng)香菊，并評(píng)價(jià)其質(zhì)量，完善了神農(nóng)香菊的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，有利于其進(jìn)一步的開發(fā)利用。

［1］ 劉啟宏，張樹藩.神農(nóng)架菊屬一新變種［J］.武漢植物研究，1983，1(2):237.

［2］ 李志浩，李鵬，朱雪松，等.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定神農(nóng)香菊中綠原酸木犀草素和蒙花苷的含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29(4):527-529.

［3］ 襲復(fù)俊，王國亮，袁曉，等.神農(nóng)香菊花的化學(xué)成分研究(Ⅱ)［J］.武漢植物研究，2005，23(6):610-612.