動(dòng)物布氏菌病的診斷

毛開榮

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀 100081）

布氏菌?。ㄓ址Q布魯氏菌病，以下簡稱布?。┦且环N細(xì)菌性人畜共患傳染病。世界大多數(shù)國家都有流行。由于帶菌動(dòng)物是其它動(dòng)物和人類布病的主要傳染源，因此，對動(dòng)物的布病的診斷、防治就成為本病防治的關(guān)鍵。迄今，有多種技術(shù)成熟、可用國際標(biāo)準(zhǔn)來標(biāo)定、比較的血清學(xué)方法可供診斷用。病原診斷也已經(jīng)有成熟的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。免疫學(xué)診斷方法方面的研究，主要集中在抗原篩選和新技術(shù)研究方面，包括脂多糖（LPS）、蛋白抗原的篩選研究，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）診斷技術(shù)、熒光偏振試驗(yàn)（FPA）診斷技術(shù)、免疫層析法診斷技術(shù)、補(bǔ)體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（CF-ELISA）診斷技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）診斷技術(shù)等。此外。對診斷技術(shù)的評價(jià)研究也有大量報(bào)道。

一、診斷標(biāo)準(zhǔn)

診斷標(biāo)準(zhǔn)是得到官方認(rèn)可的技術(shù)，具有法律效力。在布氏菌病的防控中，各國都有其診斷標(biāo)準(zhǔn)，國際組織也有其指定的或推薦的標(biāo)準(zhǔn)。各國的標(biāo)準(zhǔn)有的是相同的，有的不同，其差異主要在于技術(shù)研發(fā)的不同和根據(jù)國情對防控的需要不同。

中國有關(guān)動(dòng)物布病的標(biāo)準(zhǔn)有3個(gè)。其中《動(dòng)物布氏菌病診斷技術(shù)》（GBT 18646-2002）涉及的技術(shù)方法有：虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、全乳環(huán)狀試驗(yàn)(MRT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)?！赌膛２际暇CR診斷技術(shù)》（NY/T 1467-2007）涉及的技術(shù)方法為PCR檢測病原?！恫际暇》乐渭夹g(shù)規(guī)范》（2007年7月17日農(nóng)業(yè)部）則描述了流行特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化、病原分離鑒定，并將GBT 18646-2002的 RBT、MRT、SAT和CFT列為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，強(qiáng)調(diào)了病畜和疫情的綜合判定方法，此外對疫情的報(bào)告處理，預(yù)防和控制進(jìn)行了敘述，是比較全面的布氏菌病防控標(biāo)準(zhǔn)。中國有關(guān)人布病的標(biāo)準(zhǔn)是《布氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》WS268-2007，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定診斷的依據(jù)是流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查的方法包括用于初篩的平板凝集試驗(yàn)或RBT，血清學(xué)檢查的SAT、CFT、抗人免疫球蛋白試驗(yàn)，以及分離細(xì)菌，規(guī)定了診斷原則，疑似、確診、隱性感染診斷標(biāo)準(zhǔn)和鑒別診斷要點(diǎn)?！恫际暇z測標(biāo)準(zhǔn)》GB 16885-1997是衛(wèi)生系統(tǒng)起草和解釋的國家標(biāo)準(zhǔn)，對監(jiān)測點(diǎn)的選擇、監(jiān)測內(nèi)容、監(jiān)測方法作出了規(guī)定。

表1 歐盟成員國布病篩選和確診試驗(yàn)

表2 某地區(qū)布氏菌檢出年代分布情況

OIE作為世界貿(mào)易組織（WTO）指定負(fù)責(zé)制定動(dòng)物衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)的唯一國際組織，其《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》中關(guān)于牛布氏菌病和羊布氏菌病診斷技術(shù)也得到各國的重視。手冊中有關(guān)布病病原診斷的技術(shù)有：細(xì)菌染色與分離鑒定、PCR檢測；血清學(xué)診斷的技術(shù)有：作為國際貿(mào)易規(guī)定試驗(yàn)的RBT、緩沖平板凝集試驗(yàn)、CFT、ELISA、熒光偏振試驗(yàn)(FPA)，以及不作為規(guī)定試驗(yàn)的皮膚變態(tài)反應(yīng)、SAT、用半抗原和胞質(zhì)蛋白進(jìn)行的免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、MRT、r-干擾素試驗(yàn)。

在歐盟牛布病診斷中，多數(shù)國家用RBT作為篩選試驗(yàn)，以CFT作為確診試驗(yàn)，有些國家用SAT和 ELISA作為篩選試驗(yàn)，以CFT作為確診試驗(yàn)。對于牛奶樣品，多數(shù)國家用MRT作為篩選試驗(yàn)，以ELISA作為確診試驗(yàn)，但也有國家僅用ELISA。有些國家還用皮膚變態(tài)反應(yīng)。

美國在其2003年公布的布病消滅計(jì)劃中，布病實(shí)驗(yàn)室診斷要求是：用酸化緩沖平板凝集試驗(yàn)、快速自動(dòng)試驗(yàn)、卡片試驗(yàn)作為篩選試驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)平板凝集試驗(yàn)測定抗體滴度，用利凡諾爾試驗(yàn)、CFT、FPA作為確診試驗(yàn)。MRT、系列稀釋RBT和牛奶ELISA作為牛奶樣品的監(jiān)測試驗(yàn)。

從以上所述的國際組織和各國布病診斷標(biāo)準(zhǔn)中可以看出，對于布病診斷都采用了篩選試驗(yàn)與確診試驗(yàn)相結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，并且都以緩沖類平板凝集試驗(yàn)（包括RBT）作為主要篩選試驗(yàn)方法，在確診試驗(yàn)中都包括了CFT，說明這2種試驗(yàn)是獲得普遍認(rèn)可的布病診斷技術(shù)。而MRT則是普遍使用的牛奶樣品檢測方法。

二、診斷方法及其評價(jià)

（一）病原學(xué)診斷方法

1.細(xì)菌學(xué)方法。世界上已發(fā)現(xiàn)布氏菌有9個(gè)種，其中田鼠種布氏菌(B.microti) 2008年由德國和捷克科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在我國流行的布病病原菌主要是羊種菌，此外，還存在牛種、豬種、犬種等。

迄今，細(xì)菌學(xué)方法依然是病原診斷的主要方法。傳統(tǒng)的樣品涂片染色鏡檢、分離培養(yǎng)鑒定，雖然檢出率很低，但卻是診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。但由于細(xì)菌學(xué)檢測難以獲得帶菌樣品等原因，其檢出率很低，并且存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中使用率很低。

2.分子生物學(xué)技術(shù)。20世紀(jì)90年代以來，分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、高效成為布氏菌檢測研究較多的方法。Betsy J BricKer和Shirley M Halling在1994年針對牛、羊、綿羊、豬種布氏菌設(shè)計(jì)不同的引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增在不同種間存在重復(fù)差異的布氏菌保守重復(fù)基因單元IS711,對美國107株野外分離菌株進(jìn)行檢測，能夠全部鑒定，并與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果符合率達(dá)100%。說明這一方法在布氏菌種的鑒定方面敏感、可信，對美國流行種可以全部檢出。1999年Serpe L等報(bào)道了用PCR一步法快速檢測軟質(zhì)干酪和牛乳中的布氏菌。2000年Sreevatsan S等報(bào)道用聯(lián)合PCR對感染牛的乳汁、鼻分泌物檢測布氏菌和結(jié)核菌。Cloeckaert A等報(bào)道位于IS711序列下游的26bp基因是海洋哺乳動(dòng)物的特殊標(biāo)記。用過氧化物酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記的特異性免疫染色檢驗(yàn)技術(shù)已有報(bào)道，PCR和DNA探針技術(shù)有望不久成為病原診斷的實(shí)用方法。有一種叫做野外脈沖凝膠電泳的技術(shù)用于布氏菌病原鑒定，這種技術(shù)可以鑒別布氏菌各個(gè)種。PCR是用于鑒定布氏菌種型已是非常重要的工具，只需少量樣品即可在短時(shí)間內(nèi)得到結(jié)果， 基因指紋分析有助于流行病學(xué)研究和防控。對于布氏菌鑒定，基于PCR對方法比常規(guī)方法越來越實(shí)用，并且還在不斷發(fā)展成熟。然而，要想用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)布氏菌病檢測，其敏感性、特異性、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證還需用大量臨床樣品進(jìn)行全面驗(yàn)證。

（二）血清學(xué)診斷方法

1.凝集類試驗(yàn)。傳統(tǒng)方法的凝集試驗(yàn)（包括SAT、平板凝集試驗(yàn)）在發(fā)達(dá)國家已基本上停止使用，取代的方法是緩沖布氏菌抗原試驗(yàn)，包括卡片試驗(yàn)、RBPT、緩沖平板凝集試驗(yàn)。在國際貿(mào)易中，緩沖布氏菌抗原試驗(yàn)是牛、羊、豬種布氏菌病診斷的指定試驗(yàn)，作為篩選試驗(yàn)用。

2.補(bǔ)體結(jié)合類試驗(yàn)。CFT至今仍是布氏菌病的重要診斷方法，是牛、羊、綿羊副睪種布氏菌病診斷的國際貿(mào)易指定試驗(yàn)，作為確診試驗(yàn)用。但是，CFT不適合作為豬的個(gè)體診斷，因?yàn)樨i的補(bǔ)體干擾豚鼠補(bǔ)體而使得試驗(yàn)的敏感性降低。盡管如此，歐盟和其他一些國家還是強(qiáng)調(diào)，豬的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)價(jià)低于20個(gè)國際單位。

最近，一種新的補(bǔ)體結(jié)合類試驗(yàn)技術(shù)——補(bǔ)體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（CF- ELISA）技術(shù)得到研發(fā)，并且顯示出CFT的高特異性和ELISA的高敏感性，有望成為較理想的布氏菌病診斷技術(shù)。

（三）ELISA技術(shù) ELISA是一種高敏感性的試驗(yàn)，操作方便的診斷技術(shù)。不但可用于血清學(xué)診斷，還可用于乳汁等檢查。既可以作為確定試驗(yàn)，又可以作為篩選試驗(yàn)。但只有用于牛種布氏菌病的ELISA是國際貿(mào)易指定試驗(yàn)。豬種布氏菌和綿羊副睪種布氏菌亦已有成熟的ELISA診斷技術(shù)。其它種布氏菌病上的應(yīng)用還需進(jìn)一步改進(jìn)抗原和積累數(shù)據(jù)。

ELISA技術(shù)的特點(diǎn)是：（1）高敏感性，（2）用針對IgG類抗體的酶標(biāo)二抗提高試驗(yàn)點(diǎn)特異性。但由于此技術(shù)產(chǎn)品的質(zhì)量控制較復(fù)雜，并且只檢測IgG類抗體，在臨床使用中還存在相當(dāng)大的不穩(wěn)定性。

關(guān)于ELISA的研究報(bào)道相當(dāng)多，表明這是一種大家認(rèn)為比較有前途的診斷方法。ELISA的效果關(guān)鍵在于抗原的選用。在已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化了的牛布氏菌病ELISA診斷中，使用了S-LPS抗原，以其為基礎(chǔ)建立的方法得到了普遍認(rèn)可，也有用胞壁和胞質(zhì)蛋白進(jìn)行的ELISA，由于對這些蛋白在體液免疫反應(yīng)中的情況了解不夠，其臨床價(jià)值還需大量的研究證實(shí)。

（四）其它血清學(xué)診斷技術(shù) 由于凝集試驗(yàn)不適合綿羊副睪種布氏菌病的診斷，一種瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散(AGID)試驗(yàn)就成為綿羊副睪種布氏菌病的常用診斷方法。但未被采納作國際貿(mào)易指定試驗(yàn)。

對豬種布氏菌病來說，沒有一種傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法是適用的，主要的問題在于斷奶后2～3個(gè)月齡的豬是最易感的，但他們對感染的凝集類抗體的應(yīng)答很有限。再有，耶爾森氏菌O:9感染在豬非常普遍，而布氏菌傳統(tǒng)試驗(yàn)所使用抗原的主要有效成分——LPS與耶爾森氏菌O:9的LPS難以區(qū)分。豬血清有時(shí)還有非特異抗體（主要是IgM），對凝集類試驗(yàn)，尤其是SAT影響較大。因此，對豬布氏菌病的診斷，流行病學(xué)顯得尤為重要，貿(mào)易中應(yīng)避免從疫區(qū)引進(jìn)動(dòng)物。變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對豬種布氏菌病診斷有著很高的特異性，亦不與耶爾森氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)，但敏感性與凝集試驗(yàn)一樣比較差，不適合作為個(gè)體豬的診斷。

（五）乳環(huán)試驗(yàn)（MRT） 這個(gè)試驗(yàn)依然是奶牛布氏菌病監(jiān)測的常用技術(shù)。對于混合牛奶，有用增加試驗(yàn)牛奶樣品量來提高其敏感性的方法。也有用虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原稀釋法檢測牛奶中抗體滴度的方法。

三、疫苗免疫后布氏菌病的診斷

目前世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的布氏菌病疫苗有2種，S19和Rev.1活疫苗。中國使用的疫苗有S2、M5、S(A)19活疫苗。這些疫苗都是光滑型布氏菌制備的，免疫后都產(chǎn)生干擾診斷羊種、牛種、豬種布氏菌感染的抗體。

自20世紀(jì)50年代開始，研究者為徹底解決疫苗免疫干擾診斷的問題，開始研究粗糙型布氏菌疫苗。報(bào)道實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)有效的不少于30種，從早期Jones等研制的R6、R7滅活佐劑疫苗，到后來的45/20滅活佐劑疫苗。最后都應(yīng)免疫效果差或不是完全的無凝集原性而停止使用。上世紀(jì)90年代，美國研制出了一種粗糙型牛種布氏菌活疫苗RB51，據(jù)報(bào)道有相當(dāng)于S19疫苗的免疫效力，同時(shí)不干擾常規(guī)血清學(xué)診斷，在美國已獲得政府批準(zhǔn)正式使用。

另一類解決的方法是，通過控制免疫程序，降低和縮短疫苗免疫后的抗體反應(yīng)程度。比較成功的程序有：（1）用S19疫苗免疫3～8月齡的犢牛，6個(gè)月后，其抗體水平已降低至診斷陽性標(biāo)準(zhǔn)以下，還可以用競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）進(jìn)一步降低免疫抗體陽性反應(yīng)的可能性。（2）用S2疫苗口服免疫，適用于牛、羊、豬，并且可保證畜群的高免疫密度。其免疫抗體的反應(yīng)程度比S19免疫3～8月齡的犢牛還低，6個(gè)月后，其抗體水平已全部降低至診斷陽性標(biāo)準(zhǔn)以下。

綜上所述，在布氏菌病的診斷實(shí)踐中，科學(xué)準(zhǔn)確地判定病畜和疫情，需要以標(biāo)準(zhǔn)方法為準(zhǔn)繩，同時(shí)結(jié)合適用的新技術(shù)，可參考的技術(shù)，才能獲得理想的效果。

（略）