三黃雞α干擾素的克隆、表達及抗病毒活性初步研究

李秋霞，劉永錄，2，龔 劍，馬仲彬 ，陳乃壯，楊明鋒，張國祖，2＊

（1.河南省康星藥業(yè)有限公司，河南中牟451464；2.鄭州牧業(yè)工程高等專科學校，河南鄭州450011；3.遼寧省遼陽市種畜場，遼寧遼陽111000）

三黃雞α干擾素的克隆、表達及抗病毒活性初步研究

李秋霞1，劉永錄1，2，龔 劍1，馬仲彬1，陳乃壯3，楊明鋒1，張國祖1，2＊

（1.河南省康星藥業(yè)有限公司，河南中牟451464；2.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校，河南鄭州450011；3.遼寧省遼陽市種畜場，遼寧遼陽111000）

采用PCR方法從三黃雞血液基因組中擴增雞α干擾素全基因，并克隆和測序。序列分析表明，基因全長為582bp，亞克隆其成熟蛋白編碼基因489bp。將該片段與表達載體pET－28a連接克隆至大腸埃希菌DH5α菌株，經測序和酶切鑒定，選取正向插入、讀碼框正確的陽性克隆。構建重組質粒并轉化BL21（DE3），經IPTG誘導，融合蛋白以包涵體形式在BL21（DE3）高效表達，經His親和層析柱得以純化。雞胚試驗表明，重組干擾素抵抗新城疫病毒效果顯著，能保護雞胚并能夠延遲和減少新城疫病毒的復制。

雞α干擾素；原核表達；抗病毒活性

＊通訊作者

自Issaca等在1957年發(fā)現干擾素（interferon，IFN）以來，已經證明不論高等動物還是低等動物都有干擾素類似物質產生。干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強免疫功能的細胞因子［1］。干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。Ⅰ型干擾素包括IFN－α和IFN－β等，Ⅱ型干擾素又稱免疫干擾素即IFN－γ［2］。α干擾素主要來源于B淋巴細胞和巨噬細胞，β干擾素主要來源于成纖維細胞和上皮細胞，兩者主要活性是抗病毒。而γ干擾素是機體在發(fā)揮免疫作用后通過作用于巨噬細胞而發(fā)揮其抗病毒活性的，主要由 T 淋巴細胞產生［3－4］。

雞α干擾素（chicken interferon－alpha，ChIFN－α）全基因為582個堿基，編碼193個氨基酸，其中前31個氨基酸為信號肽，后162個氨基酸為成熟蛋白，蛋白分子質量約為19ku。Sekellick M J等［5］于1994年首次成功克隆和表達了ChIFN－α基因，并進行了結構分析。文獻報道已成功克隆了惠陽胡須雞［6］和絲羽烏骨雞IFN－α基因［7］。陳紅英等［8］用原核表達系統(tǒng)表達了雞α干擾素，并證明表達產物在細胞上有抗病毒活性。

近年來，干擾素一直是病毒學、細胞學、分子生物學、臨床醫(yī)學、免疫學、腫瘤學等相關領域的研究熱點。隨著抗菌藥物的大量使用，藥物殘留和抗藥性問題急需解決。干擾素有著抗生素無法替代的作用，干擾素因其作用機理的獨特性而具有廣譜的抗病毒活性和免疫增強作用［9－10］。研究表明，重組干擾素與天然干擾素具有同樣的抗病毒和免疫調節(jié)活性，因此重組干擾素的研究和應用將成為家禽養(yǎng)殖中增強雞的免疫，減少發(fā)病，降低雞的死亡率的重要方向［11－12］。本研究應用PCR方法從三黃雞血液中克隆了IFN－α基因，并在大腸埃希菌中獲得了高效表達，為重組干擾素作為新型廣譜抗病毒生物制劑奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質粒和菌株 原核表達載體pET28a、大腸埃希菌（Escherichiacoli）DH5α和BL21由河南省康星藥業(yè)有限公司研發(fā)部實驗室保存。

1.1.2 雞胚和病毒 9日齡雞胚為鄭州瑞祥孵化廠孵化；新城疫病毒由河南農業(yè)大學禽病研究所惠贈。

1.1.3 酶和試劑 限制性內切酶NcoⅠ、NheⅠ、SalⅠ為Fermentas公司產品；普通DNA產物回收試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、普通DNA聚合酶、蛋白質Marker和Bradford蛋白定量測定試劑盒為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；IPTG、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為Genview公司（北京）產品；Tris堿為Sigma公司產品；His－Bind Resin為BBI公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計 參照NCBI中已發(fā)表的雞α干擾素基因序列（AB021154），利用Primer Premier 5.0軟件設計2對引物。CKF1：5－CCATGGCTGTGCCTGCAAGCCCACAGC－3（NcoⅠ），CKR1：5－CTTGTCGACCTAAGTGCGCGTGTTGCCTGT－3（SalⅠ）；CKF2：5－CTTGCTAGCTGCAACCACCTTCGCCCCCAG－3 （NheⅠ ），CKR2：5－CTTGTCGACCTAAGTGCGCGTGTTGCCTGT－3（SalⅠ）。用于擴增雞IFN－α全基因（CKF1和CKR1）和去信號肽的成熟蛋白編碼基因（CKF2和CKR2）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 雞α干擾素全基因的PCR擴增、克隆與序列測定 參照《分子克隆試驗指南》，從三黃雞血液中提取基因組DNA。以提取的DNA為模板，采用引物CKF1和CKR1進行PCR擴增。反應程序為94℃預變性3min；94℃30s，55℃45s，72℃1min進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳，參照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收582bp處DNA帶，回收的PCR產物與pET－28a載體連接，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。挑取數個菌落分別接種于3mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。提取重組質粒進行酶切和測序鑒定。

1.2.3 原核表達載體pET28a－ChIFN－α的構建與鑒定 利用特異性引物CKF2和CKR2，以經過測序確定含正確ChIFN－α全長基因的質粒為模板，擴增雞α干擾素成熟蛋白基因。反應程序如1.2.2，擴增后用10g/L瓊脂糖電泳檢測，回收特異的DNA條帶。用NheⅠ和SalⅠ雙酶切回收的PCR產物，電泳、分離和回收IFN－α片段。將IFN－α片段定向插入到同樣處理的原核表達載體pET28a中，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，選單個菌落進行PCR和雙酶切鑒定，陽性質粒命名為pET28a－ChIFN－α，并送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 重組質粒的誘導表達及其表達產物的可溶性分析 將測序正確的pET28a－ChIFN－α轉化E.coliBL21感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種于10mL含Kan（50mg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)過夜的菌液1mL轉接到100mL新鮮的含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2h～3h，當OD600達0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)4h，同時用未誘導的菌液作為陰性對照。取1mL誘導后菌液，離心，收集菌體，菌體用100μL PBS懸浮待用，剩余的菌液離心，離心后的菌體冰上放置30min后用20 mL PBS懸浮，然后利用超聲破碎儀（360W，30%，5 min）超聲5次，4℃、12 000r/min離心15min，分為上清液和沉淀，沉淀用200μL PBS溶解，制備電泳樣品。

1.2.5 重組雞IFN－α的純化 將大量誘導離心后的菌體重懸于50mL PBS中，冰上放置30min，超聲裂解破碎細胞（360W，30%，5min重復5次），4℃、12 000r/min離心15min，棄上清液，得包涵體沉淀。將沉淀分別用含2mol/L Urea、4mol/L U－rea的PBS洗滌，離心，去上清液。然后將包涵體溶解于40mL 結合緩沖液中（0.6mol/L NaCl，0.05 mol/L NaH2PO4，10mmol/L咪唑，8mol/L Urea，pH8.0）。包涵體溶解后，4 ℃、12 000r/min離心15min，取上清，與His－Bind（結合緩沖液預先平衡）樹脂結合1.5h，用4體積含40mmol/L咪唑的漂洗、250mmol/L咪唑洗脫緩沖液（0.6mol/L NaCl，0.05mol/L NaH2PO4，8mol/L Urea，pH 8.0）漂洗、洗脫蛋白，收集漂洗液和洗脫液，120g/L SDSPAGE電泳檢測。

1.2.6 重組蛋白的體外復性 將純化后含目的條帶的洗脫液裝入透析袋中，按下列方法透析：基礎復性液為PBS，尿素梯度為6、4、2、0mol/L，每個梯度透析12h，最后在水中透析24h，吸出透析袋中的液體，4℃、12 000r/min離心10min，取上清并用Bradford法測定目的蛋白濃度，然后將目的蛋白濾過除菌，置－20℃保存。

1.2.7 重組雞IFN－α抗病毒活性測定 將新城疫病毒液在無菌條件下進行10倍倍比稀釋，經尿囊腔接種9日齡雞胚，200μL/枚，每個稀釋度接種6枚，37℃孵育6d，測定EID50。根據測定的EID50，選擇9日齡雞胚36枚。隨機分為6組，每組6只，將兩種病毒稀釋至100EID，每枚注入100μL病毒稀釋液。接病毒同時，每組分別注入不同劑量的干擾素（空白對照組、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5μg）。每天照蛋1次～2次，棄去24h內死亡的雞胚。4d后將雞胚取出，測定病毒效價。

2 結果

2.1 原核表達載體pET28a－ChIFN－α的構建與鑒定

以三黃雞血液基因組DNA為模板，擴增出ChIFN－α全基因后，利用特異性引物CKF2和CKR2，以經過測序確定含正確ChIFN－α全長基因的質粒為模板，擴增雞α干擾素成熟蛋白基因。擴增后用10g/L瓊脂糖電泳檢測，去信號肽的ChIFN－α基因PCR擴增產物為489bp（圖1），片段大小與預期片段大小相等。PCR回收產物與pET28a載體連接后，轉化DH5α，挑單菌落提取質粒后進行雙酶切鑒定（圖2）。將酶切鑒定均為陽性的重組質粒進行測序。測序結表明，目的基因已成功地克隆到pET28a載體上。

圖1 ChIFN－α基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of ChIFN－αgene

圖2 重組質粒pET28a－ChIFN－α基因雙酶切驗證Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a－ChIFN－α digested by NheⅠand SalⅠ

2.2 重組蛋白的誘導表達及表達產物的可溶性分析

SDS－PAGE 結 果 顯 示，誘 導 后 的 pET28a－ChIFN－α在約22ku處有一條很濃的特異性條帶，與預期大小一致，未經誘導的pET28a－ChIFN－α轉化菌則無此條帶。將誘導后重組菌株進行超聲裂解后，分別取上清液和沉淀進行SDS－PAGE，重組蛋白以包涵體形式表達（圖3）。

2.3 重組雞IFN－α的純化

重組菌超聲后包涵體經His親和層析柱純化后獲得到了純化的重組雞IFN－α（圖4），純化后的蛋白用透析法復性后，Bradford蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度為326μg/mL。

2.4 重組雞IFN－α抗病毒活性

將9日齡雞胚隨機分為6組，每組注入100μL新城疫病毒稀釋液。接病毒同時，每組分別注入不同劑量的干擾素（0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5μg）。每天照蛋1次～2次，棄去24h內死亡的雞胚。4d后將雞胚取出，測定病毒效價，每組取平均值（表1）。

圖3 pET28a－ChIFN－α蛋白的SDS－PAGE分析Fig.3 SDS－PAGE analysis of pET28a－ChIFN－αprotein

圖4 表達純化產物SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of purified fusion protein

表1 重組干擾素親和層析蛋白在雞胚上對新城疫病毒的抑制效果Table 1 The protein purified by nickel affinity chromatography resistant to NDV on chick embrvo

3 討論

目前，隨著我國養(yǎng)雞規(guī)模的不斷擴大和集約化程度的不斷提高，新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎等病毒性疾病所帶來的危害越來越嚴重，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大的經濟損失。干擾素作為一類重要的細胞因子，由生物體細胞受到病毒或其他誘生劑的作用而產生的分泌性蛋白，具有抗病毒、抗細胞增殖、免疫調節(jié)等多種生物學活性。自1986年以來，各型重組干擾素相繼投放市場，在醫(yī)學臨床治療過程中發(fā)揮了巨大作用，而且副作用較輕。與人醫(yī)相比，禽類干擾素分子生物學研究相對滯后。本研究根據NCBI上的基因序列（序列號為AB021154），利用SignalP 3.0Server軟件預測此基因可能含有一段信號肽序列，為其氨基酸序列的前31個氨基酸，利用TargetP 1.1Server軟件檢測此序列功能，發(fā)現其為幫助蛋白分泌的信號肽而非蛋白結構所必需，由于雞α干擾素為真核生物干擾素，但后續(xù)研究需要在原核生物中進行表達，真核生物的信號肽在原核生物細胞環(huán)境中由于缺少相應的受體而不能發(fā)揮作用，所以我們去掉信號肽序列，剩下編碼成熟雞α干擾素的基因序列。本試驗應用PCR技術從三黃雞血液中克隆了雞IFN－α基因，構建原核表達載體pET28a－ChIFN－α，雞IFN－α獲得了成功表達，為該基因的免疫學和生物學研究奠定了基礎。

為了驗證干擾素對新城疫病毒的抑制效果，本研究選用9日齡雞胚作為試驗對象。結果表明，干擾素用量在0μg～13.5μg之間時，隨著干擾素用量的增加，病毒的凝集價降低，說明干擾素對新城疫病毒有一定的抑制效果。但是干擾素量增加至40.5 μg時，病毒的凝集價比13.5μg時稍高，可能是因為干擾素用量較大時有一定的副作用。

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Molecular Cloning，Expression and Antiviral Activity of Three－Yellow Chicken IFN－α

LI Qiu－xia1，LIU Yong－lu1，2，GONG Jian1，MA Zhong－bin1，CHEN Nai－zhuang3，YANG Ming－feng1，ZHANG Guo－zu1，2

（1.HenanProvinceHealthStarPharmaceuticalCO.，LTD，Zhongmou，Henan，451464，China；2.ZhengzhouCollegeofAnimalHusbandry Engineering，Zhengzhou，Henan，450011，China；3.LiaoyangCity，LiaoningProvinceBreedingStockMarket，Liaoyang，Liaoning，111000，China）

The full length of chicken interferon alpha gene was amplified by polymerase chain reaction from the genome DNA of Three－Yellow chicken blood，and then sequenced.The amplified gene was 582bp.The coding region（489bp）for mature protein was subcloned into the prokaryotic expression vector pET－28a.The recombinant vector was cloned intoEscherichiacoliDH5αstrain.The positive clone gene with correct reading frame was confirmed by sequencing and enzyme digestion.The results of SDS－PAGE revealed that the recombinant plasmid that was transformed into BL21（DE3）was highly expressed after induction by IPTG and the 22ku fusion protein was expressed in the form of inclusion bodies.The recombinant protein was purified with His－Bind affinity chromatography.Chick embryo tests showed that recombinant chicken interferon alpha can protect chick embryo from NDV infection.Recombinant chicken interferon alpha can also delay and reduce the NDV replication significantly.

chicken interferon alpha；prokaryotic expression；antiviral activity

Q789

A

1007－5038（2011）10－0063－04

2011－04－20

企業(yè)基金項目資助

李秋霞（1981－），女，山東聊城人，實驗員，碩士研究生，主要從事生物制藥研究。