泌乳期山羊腺垂體中ERα和ERβ的分布特點(diǎn)

呂顏枝，楊 爽，胡鵬翔，熊東升，耿陽(yáng)雪，蔣振興，趙慧英

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西楊陵712100）

泌乳期山羊腺垂體中ERα和ERβ的分布特點(diǎn)

呂顏枝，楊 爽，胡鵬翔，熊東升，耿陽(yáng)雪，蔣振興，趙慧英＊

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西楊陵712100）

為了獲得ERα和ERβ在泌乳期參與腺垂體激素分泌的調(diào)節(jié)機(jī)理的形態(tài)學(xué)依據(jù)，試驗(yàn)采集泌乳初期、泌乳中期和泌乳后期山羊的腺垂體，用免疫組化SP法檢測(cè)了ERα和ERβ在腺垂體的分布。結(jié)果表明，山羊腺垂體中ER兩種亞型分布在腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部的嗜色細(xì)胞中；ERα陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨泌乳時(shí)間逐漸減少，泌乳初期和泌乳后期多呈胞質(zhì)陽(yáng)性，高峰期呈胞核陽(yáng)性；ERβ的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在泌乳初期和高峰期較多，泌乳后期較少，多為胞質(zhì)陽(yáng)性，高峰期伴有全細(xì)胞陽(yáng)性，泌乳后期伴有個(gè)別核陽(yáng)性。提示不同的泌乳時(shí)期ERα和ERβ分別分布在腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部中不同的嗜色細(xì)胞，泌乳前期和高峰期主要為PRL細(xì)胞，泌乳后乳期主要為嗜堿粒細(xì)胞，ERα和ERβ在泌乳各期腺垂體激素分泌中發(fā)揮不同的作用。

山羊腺垂體；泌乳期；雌激素受體；免疫組化

＊通訊作者

雌激素（estrogen）是一種作用廣泛的類固醇激素［1］，主要由卵巢的卵泡上皮細(xì)胞和卵巢間質(zhì)細(xì)胞分泌。卵巢雌激素的分泌受垂體促性腺激素的調(diào)節(jié)，同時(shí)雌激素也可以通過長(zhǎng)反饋途徑調(diào)節(jié)腺垂體激素的分泌。雌激素這些效應(yīng)必須通過與其特異性的雌激素受體（estrogen receptor，ER）相結(jié)合后才能發(fā)揮，經(jīng)典的ER主要由ERα和ERβ兩種亞型組成［2］，分布于機(jī)體多種組織器官。在功能上ER介導(dǎo)的雌激素效應(yīng)可能有所不同，但也可能協(xié)同發(fā)揮作用，ERα主要參與對(duì)生殖調(diào)控的作用，ERβ可能主要參與了對(duì)高級(jí)腦功能，如學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)退行性疾病等的調(diào)節(jié)。有研究表明［3－6］，大鼠垂體組織中存在ER的表達(dá)；雌激素可誘發(fā)大鼠催乳素（prolactin，PRL）細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增加，導(dǎo)致PRL的釋放，ER頡頏劑可以阻止這種作用；腦垂體內(nèi)幾乎所有的催乳素陽(yáng)性細(xì)胞都不表達(dá)ERβ，而ERα對(duì)泌乳中樞的調(diào)節(jié)起著主要作用。目前，對(duì)于泌乳期山羊腺垂體中的ER的分布研究報(bào)道的很少，本試驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP法對(duì)ERα和ERβ免疫反應(yīng)產(chǎn)物在泌乳期山羊腺垂體細(xì)胞中的分布進(jìn)行研究，為闡述山羊泌乳期的生理調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

自陜西楊陵區(qū)農(nóng)戶購(gòu)買泌乳初期（當(dāng)年2月份），泌乳中期（當(dāng)年4月～5月份），泌乳后期（當(dāng)年6月～7月份）的健康山羊各5只，共15只?？雇面溍咕股锼兀鞍走^氧化酶免疫組化超敏SP試劑盒、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液，為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品；兔抗羊ERα和ERβ多克隆抗體及抗體稀釋液為北京博奧森生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；德國(guó)Leica石蠟切片機(jī)，Motic數(shù)碼顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 取材及材料處理 山羊放血處死后迅速取下羊頭，先用37℃的生理鹽水向兩側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)注入400mL～500mL沖干凈血液，隨后灌流4℃40g/L多聚甲醛固定液400mL～500mL，開顱取出垂體放入40g/L多聚甲醛固定液后固定24h。固定后的垂體用流水沖洗24h，再用梯度酒精脫水，二甲苯透明，之后浸蠟包埋，做石蠟連續(xù)切片（片厚6μm）。制作的石蠟切片貼于APES包被好的載玻片上，45℃ 烘箱烤片，共制備3套切片，分別用于ERα、ERβ免疫組織化學(xué)染色和陰性對(duì)照。

1.2.2 SP法染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，用構(gòu)椽酸鹽緩沖液（pH6.0）對(duì)切片進(jìn)行組織熱抗原修復(fù)20min，冷卻后進(jìn)行免疫組織化學(xué)SP染色。免疫組織化學(xué)SP染色流程如下：①滴加過氧化物酶阻斷液（試劑A）室，室溫孵育10min；②滴加非免疫動(dòng)物血清（試劑B），室溫孵育10min～15min；③分別滴加兔抗羊（ERα、ERβ）多克隆抗體（稀釋度為1∶200），4℃孵育過夜；④滴加生物素標(biāo)記的二抗（試劑C），室溫孵育10min～15min；⑤滴加鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶溶液（試劑D），室溫孵育10min～15min；以上每個(gè)步驟之間均用0.01mol/L的PBS緩沖液沖洗5min×3次，試驗(yàn)中的試劑A、B、C、D均來(lái)自SP試劑盒；然后用DAB呈色3min～5 min。陰性對(duì)照組用0.01mol/L的PBS代替一抗，其他步驟同上。最后經(jīng)蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察、攝影。

2 結(jié)果

在整個(gè)泌乳時(shí)期的山羊腺垂體中均見到ERα、ERβ免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布于遠(yuǎn)側(cè)部的嗜色細(xì)胞，其數(shù)量和免疫陽(yáng)性產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置隨著泌乳時(shí)期的不同而發(fā)生變化。ERα陽(yáng)性細(xì)胞多分布于腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部血竇周圍，著色細(xì)胞的數(shù)量隨泌乳逐漸減少。泌乳初期多數(shù)分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖1A），泌乳高峰期多分布于胞核，少量分布于胞質(zhì)中（圖1B）；乳期后期多分布于細(xì)胞質(zhì)中，個(gè)別囊泡深著色（圖1C）。

ERβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多，在腺垂體的分布較集中，細(xì)胞個(gè)體相對(duì)于ERα陽(yáng)性細(xì)胞大，泌乳初期免疫陽(yáng)性產(chǎn)物多分布于胞質(zhì)，也有個(gè)別全細(xì)胞著色（圖2A）；泌乳高峰期全細(xì)胞著色增多（圖2B）；泌乳后期陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，多數(shù)為胞質(zhì)著色，伴有個(gè)別核著色（圖2C）。

圖1 泌乳各期腺垂體中ERα的分布（400×）Fig.1 The distribution of ERαin pituitary during different lactation periods（400×）

圖2 圖2泌乳各期腺垂體中ERβ的分布（400×）Fig.2 The distribution of ERβin pituitary during different lactation periods（400×）

3 討論

泌乳啟動(dòng)和維持受PRL等激素的調(diào)節(jié)［8］。雌激素通過刺激垂體前葉合成與釋放催乳素，促進(jìn)乳腺的發(fā)育；大劑量的雌激素可競(jìng)爭(zhēng)催乳素受體，從而抑制催乳素的促泌乳作用。在妊娠期，大量的雌、孕激素抑制了催乳素的促泌乳作用；分娩后，雌激素、孕激素水平迅速下降，解除了對(duì)催乳素的抑制作用，同時(shí)催乳素的分泌也大量增加，促進(jìn)乳腺開始泌乳；隨著規(guī)律性哺乳的建立，刺激垂體前葉分泌催乳素，從而維持泌乳。研究表明［9－11］在妊娠和泌乳期間腺垂體內(nèi)的PRL細(xì)胞由于雌激素的刺激而發(fā)生增生和肥大，ER在分泌PRL和PRL細(xì)胞增生方面起重要作用，PRL細(xì)胞的大小和形態(tài)的變化與妊娠、泌乳等生殖周期密切相關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ERα和ERβ在泌乳初期和高峰期內(nèi)胞體較大，且ERβ在高峰期時(shí)數(shù)量增多，泌乳后期時(shí)胞體變小、數(shù)量急劇減少，提示泌乳前期和高峰期ERα和ERβ陽(yáng)性細(xì)胞可能主要是PRL細(xì)胞，泌乳后期可能主要是嗜堿性細(xì)胞，兩者共同參與了雌激素對(duì)泌乳期的生理調(diào)節(jié)，而泌乳高峰期是主要是ERβ起主要作用。但是確定ERα和ERβ具體定位于腺垂體中的何種激素分泌細(xì)胞，仍需做雙標(biāo)和其他細(xì)胞類型的鑒定研究。

張慶紅等［12］對(duì)大鼠垂體中ER的分布研究中發(fā)現(xiàn)，ERα免疫反應(yīng)物質(zhì)位于細(xì)胞核內(nèi)，ERβ免疫反應(yīng)物質(zhì)位于胞質(zhì)和胞膜。本試驗(yàn)結(jié)果表明，泌乳過程中山羊腺垂體細(xì)胞中ERα和ERβ免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)在細(xì)胞的定位不同，ERα多數(shù)位于胞質(zhì)，少數(shù)存在于細(xì)胞核內(nèi)，ERβ主要存在于胞質(zhì)，個(gè)別全細(xì)胞著色，與上述的研究結(jié)果不完全一致，這提示不同的動(dòng)物在不同的生理時(shí)期內(nèi)ERα和ERβ在腺垂體中定位于不同的細(xì)胞中不同的位置，提示ER兩種亞型在腺垂體中的分布的細(xì)胞類型不一樣，在介導(dǎo)雌激素的作用可能有所側(cè)重。

［1］ 鄭可佳，楊彩榮，張 巖，等.ERβ及ERβ在小鼠發(fā)情周期卵巢內(nèi)的表達(dá)［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，7（7）：85－89.

［2］ 樊官偉，何 俊，王 虹，等.雌激素及其受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12（3）：266－269.

［3］ 張韶峰，徐 春，付淑云.雌激素和多巴胺對(duì)大鼠垂體組織中雌激素受體基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（8）：55－69.

［4］ 龍 敏，趙慧英，陳樹林，等.17－β雌二醇對(duì)去卵巢大鼠垂體中Bcl－2和Bax表達(dá)的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（9）：1262－1266.

［5］ Nie W，Zhang Y X.Role of estrogen in cognitive function and prevention of neuronal loss in hippocampus［J］.Chinese J Pharmacol Toxicol，2001，15（5）：21－325.

［6］ Bulayeva N N，Wozniak A L，LashL L，et al.Mechanisms of membrane estrogen receptor alpha mediated rapid stimulation of Ca2＋levels and prolactin release in a pituitary cell line［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，288（2）：388－397.

［7］ 李聯(lián)祥，李 沛，王秋麗.雌激素α和β受體在大鼠結(jié)膜上皮和Henle腺上的分布［J］.解剖學(xué)報(bào)，2008，4（2）：235－237.

［8］ 李慶章.乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2009：65－67..

［9］ 步星耀，張?jiān)讫垼瑥?峰.垂體腺瘤與妊娠的關(guān)系［J］.實(shí)用診斷與治療雜志，2005，19（11）：811－813.

［10］ Stefaneanu L.Pituitary sex steroid receptors：localization and function［J］.Endocr Pathol，1997，8（2）：91－108.

［11］ 成令忠.現(xiàn)代組織學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2003：531－538.

［12］ 張慶紅，陳亞瓊，胡玉珍，等.雌激素受體在大鼠垂體前葉的分布［J］.解剖學(xué)報(bào)，2001，32（3）：352－354.

Distribution of ERαand ERβin the Adenohypophysis of the Lactating Goats

L¨UYan－zhi，YANG Shuang，HU Peng－xiang，XIONG Dong－sheng，GENG Yang－xue，JIANG Zhen－xing，ZHAO Hui－ying

（CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA＆FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China）

In order to sthdy the distribution characteristics of ERαand ERβin the adenohypophysis of the lactating goats，the adenohypophysis of in early－lactation，peak lactation and later lactation goats were collected and made to slices to observe the localization of ERαand ERβpositive substance respectively by using immunohistochemical SP method.The results showed the ERαand ERβpositive cells mainly locate in eosinophils in the pars distalis of adenohypophysis.ERαpostive cells gradually decrease during lactation period，and mainly locate in cytoplasma in the early lactation and later lactation and in nucleus in peak lactation.The majority of ERβpositive cells scatter in the early lactation and the peak lactation，a few in the later lactation，and the positive products mainly distribute in cytoplasma.Whole－cell are colored in the peak lactation.The result indicated that ERαand ERβdistributed during different chromophil cells in the pars distalis of adenohypophysis In different lactation periods.ERαand ERβmay play a different role in the adenohypophysis hormone secretion during different lactation periods.

adenohypophysis；lactation；estrogen receptor；immunohistochemistry

S852.13

A

1007－5038（2011）10－0044－03

2011－04－29

西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家級(jí)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心項(xiàng)目；抗病轉(zhuǎn)基因牛新品種選育重大專項(xiàng)（2009ZX08007－008B）

呂顏枝（1984－），女，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事神經(jīng)免疫內(nèi)分泌調(diào)控研究。