金花葵花總黃酮對(duì)衰老模型小鼠抗氧化和免疫功能的影響

吳正平

(宜春學(xué)院美容醫(yī)學(xué)院，江西 宜春 336000)

金花葵(Hibiscus manihot L)，又名菜芙蓉，為錦葵科秋葵屬1年生草本植物，是瀕于滅絕的珍稀植物?；ň哂惺秤谩⑺幱?、保健等功能，有較高的利用價(jià)值，主要活性成分為生物黃酮〔1〕。本研究采用D-半乳糖腹腔注射昆明種小鼠建立亞急性衰老模型，觀察金花葵花總黃酮對(duì)其抗氧化和免疫功能的影響，以探討金花葵花總黃酮延緩衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)選用昆明種健康小鼠40只(南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào):贛醫(yī)動(dòng)字第02196-02)，體重20～25 g，雄性，隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組，亞急性衰老模型組，金花葵花總黃酮低劑量和高劑量給藥組。

1.1.2 藥品制備 取宜春市渥江鄉(xiāng)種植的金花葵干花，粉碎，過2號(hào)篩，按單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了的金花葵花總黃酮提取工藝:液料比15∶1、溫度75℃、乙醇濃度75%、時(shí)間2.5 h，提取液放涼，濾過，濾液回收乙醇至生藥與濃縮液體積比約為1∶1，將濃縮液通過聚酰胺柱，加水30倍量(洗脫用水體積∶聚酰胺用量)洗脫，棄去洗脫液，再加30%乙醇洗脫，至洗脫液的三氯化鋁反應(yīng)為陽性，棄去洗脫液，加氨試液洗脫，收集洗脫液，至洗脫液的三氯化鋁反應(yīng)為陰性，將氨試液洗脫液合并，減壓濃縮，真空干燥，即得金花葵花總黃酮提取物。三氯化鋁法測(cè)定提取物中總黃酮的含量為45.40%。

1.1.3 試劑 D-半乳糖、人刀豆素A(ConA)、脂多糖(LPS)、噻唑籃(MTT)均為Sigma公司產(chǎn)品;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀(美國伯樂，型號(hào):680型);紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津，型號(hào):UA-240)。

1.2 方法

1.2.1 造模 取亞急性衰老模型組和金花葵花總黃酮低、高劑量給藥組小鼠，頸背部皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，正常組頸背部皮下注射生理鹽水，1次/d，連續(xù)42 d。

1.2.2 給藥 金花葵花總黃酮給藥組小鼠在注射D-半乳糖期間灌胃(ig)金花葵花總黃酮:低劑量給藥組40 mg/kg;高劑量給藥組80 mg/kg，1次/d。正常組與模型組予以生理鹽水。

1.2.3 血清SOD、MDA及GSH-Px測(cè)定 各組小鼠于第42天末次給藥2 h后，稱質(zhì)量，眼球后靜脈叢毛細(xì)管取血，靜置后3 500 r/min離心10 min，取血清備用。分別嚴(yán)格按試劑盒操作程序測(cè)定。

1.2.4 胸腺、脾指數(shù)測(cè)定 無菌條件下剖取上述實(shí)驗(yàn)中小鼠的胸腺和脾，用生理鹽水洗去血跡，剪去脂肪及筋膜組織，用濾紙吸干，稱質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g);脾指數(shù)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.2.5 MTT法淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將上述脾臟無菌操作制備成脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×109/L，取40孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加脾細(xì)胞0.2 ml，ConA(T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng))15μl(終濃度為6 mg/L)或LPS(B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng))20μl(終濃度為50 mg/L)，一個(gè)樣品加3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)板加蓋置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處讀取光密度值(OD)，并計(jì)算刺激指數(shù)SI，SI=實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠狀態(tài) 正常組小鼠精神好，行動(dòng)敏捷;毛發(fā)光澤、順滑。模型組小鼠精神萎靡、嗜臥、行動(dòng)遲緩;食欲明顯下降;毛色干枯無光澤。金花葵花總黃酮給藥組小鼠上述表現(xiàn)與模型組比較有良性逆轉(zhuǎn)。

2.2 金花葵花總黃酮對(duì)小鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影響 與正常組比較，模型組血清MDA水平顯著升高(P＜0.01)，SOD和GSH-Px水平顯著降低(P＜0.01);與給藥組比較，模型組血清MDA水平顯著降低(P＜0.01)，SOD和GSH-Px水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 金花葵花總黃酮對(duì)小鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影響(x ± s，n=10)

2.3 金花葵花總黃酮對(duì)小鼠胸腺、脾指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均顯著降低(P＜0.01)。給藥組可使衰老小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)升高(P＜0.05)。見表2。

2.4 金花葵花總黃酮對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 與正常組比較，模型組脾 T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著降低(P＜0.01);與給藥組比較，模型組脾T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均明顯升高(P＜0.05)。見表3。

表2 金花葵花總黃酮對(duì)衰老小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響(x ± s，n=10)

表3 金花葵花總黃酮對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(x ± s，n=10)

3 討論

人體衰老機(jī)制極為復(fù)雜，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)眾多衰老的學(xué)說中，衰老的免疫學(xué)理論占有重要地位〔2，3〕。衰老的免疫學(xué)理論認(rèn)為，免疫系統(tǒng)從根本上參與了正常脊椎動(dòng)物衰老過程，是衰老過程的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一，隨著年齡的增長(zhǎng)，免疫器官老化，免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子發(fā)生改變，機(jī)體的免疫功能逐漸減弱，從而引起脾、胸腺指數(shù)等免疫指標(biāo)下降。衰老的自由基理論由Harman提出〔4〕，受到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究者的普遍認(rèn)同。衰老的自由基理論認(rèn)為，隨著年齡的增加，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除失去平衡，過多自由基的產(chǎn)生可引起不同程度的細(xì)胞毒及瞬時(shí)的不可逆損傷，最終引起機(jī)體衰老。SOD是組織細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶，能催化氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，使其進(jìn)一步生成H2O2，而GSH-Px則能使H2O2迅速清除，這樣兩者共同作用能有效地阻止組織細(xì)胞受過氧化的損傷。但隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)的SOD和GSH-Px活性逐漸減低。而機(jī)體內(nèi)氧自由基可誘發(fā)生物膜不飽和脂肪酸-花生四烯酸過氧化，生成MDA等脂質(zhì)過氧化物的代謝物，因此MDA是衡量機(jī)體內(nèi)自由基代謝的敏感指標(biāo)，客觀反映體內(nèi)自由基的水平。

本研究結(jié)果表明，金花葵花總黃酮可對(duì)D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠的脾、胸腺指數(shù)，脾T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，血清MDA、SOD、GSH-Px等多項(xiàng)指標(biāo)施加影響，明顯提高其脾、胸腺指數(shù)及T、B淋巴細(xì)胞增殖能力，降低血清MDA含量并使SOD、GSH-Px水平升高，從增強(qiáng)衰老小鼠抗氧化和免疫功能的角度證明了金花葵花總黃酮延緩衰老的作用。

1 仇 燕．菜芙蓉花中總黃酮微波提取的研究〔J〕．中藥材，2006;29(4):387-90.

2 史進(jìn)方，顧國浩，張學(xué)光.免疫衰老及其免疫學(xué)預(yù)警指標(biāo)〔J〕.現(xiàn)代免疫學(xué)，2005;25(4):347-9.

3 Brink TC，Regenbrecht C，Demetrius L，et al.Activation of the immune response is a key feature of aging in mice〔J〕.Biogerontology，2009;10(6):721-34.

4 Bokov A，Chaudhuri A，Richardson A．The role of oxidative damage and stress in aging〔J〕．Mech Aging Dev，2004;125(10-11):811-26.