藍玉簪龍膽提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌作用的實驗研究

劉菁菁，李旭波，耿 錚，張 弦，侯 穎，劉水冰，許文忠，田 瓊

(1.第四軍醫(yī)大學藥學系藥理學教研室，陜西西安 710032;2.中國人民解放軍66347部隊，河北保定 071000;3.云南耿馬縣人民醫(yī)院藥劑科，云南 耿馬 677500)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)是醫(yī)院、社區(qū)感染的主要病原菌，幾乎對所有β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，甚至累及到大環(huán)內酯類、喹諾酮類和氨基糖苷類等抗菌藥物［1］，自1997年報道首例金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感度降低后，其對替考拉寧也出現(xiàn)中介敏感［2－3］，這一現(xiàn)狀成為臨床亟待解決的問題之一。尋找新的抗耐藥菌藥物是各國藥學研究者面臨的重大任務，除了新型抗生素外，我國的中醫(yī)中藥正顯現(xiàn)出獨特療效［4］。

藍玉簪龍膽(Gentiana veitchiorumHemel)，系龍膽科龍膽屬植物，生長于我國西藏中東部的高海拔草地中，藥用部位為其干燥花及地上部分。味苦性寒、無毒，主治天花、氣管炎、目赤頭痛，咽炎，濕熱黃疸等癥［5］。在前期研究中，藍玉簪對于慢性支氣管炎、肺纖維化動物模型有較好的療效［6－7］，由于細菌感染是慢性支氣管炎、肺纖維化的致病因素之一，并且清熱、解毒、燥濕類中草藥有一定抑菌作用，本實驗針對肺部疾病常見的MRSA感染，對藍玉簪龍膽的抑菌作用做一研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1儀器DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司;SW-CJ-1F工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;麥氏比濁管，西安市君利生物科技有限公司;電子天平、手術器械等。

1.1.2試劑胃粘蛋白(mucin)，Sigma公司，配成體積分數為0.05后121℃ 15 min滅菌，用于稀釋菌液。M-H培養(yǎng)基(Mueller-Hinton Agar)，批號:20080326，北京奧博星生物技術有限責任公司;營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar)，批號:20080602，北京奧博星生物技術有限公司;Mueller-Hinton肉湯(MHB)，批號:080430，北京陸橋技術有限責任公司;用于MRSA的M-H肉湯及培養(yǎng)基加入體積分數為0.02的氯化鈉。氯化鈉，天津市津北精細化工有限公司。甲醛溶液，天津市紅巖化學試劑廠;乙醇，批號:0806073301，安徽安特生物制品有限公司;石油醚，批號:20081222，天津化學試劑有限公司;乙酸乙酯，批號:20080228，天津化學試劑有限公司;三氯甲烷，批號:20080115，國藥集團化學試劑有限公司;正丁醇，批號:20080430，天津津北精細化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.1.3實驗藥品藍玉簪龍膽采自西藏高原，為藍玉簪龍膽的花及莖葉。藍玉簪龍膽有機溶劑提取物制備:藍玉簪龍膽1.5 kg，浸泡于30 L體積分數為0.75的乙醇中48 h，重復3次，收集濾液。旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸餾至無醇浸膏，得640.21 g藍玉簪乙醇提取物。蒸餾水溶解醇提物至8 L，依次用氯仿、正丁醇萃取，分別得到氯仿提取物72.13 g;正丁醇提取物57.92 g，水層提取物482.65 g。。藍玉簪龍膽水煎液制備:稱取藍玉簪龍膽40 g水煎2次，濾液合并濃縮至250 ml，得到濃度為0.16 g·ml－1受試藥物(相當4 g·kg－1)。注射用頭孢唑啉，批號:8081037308，哈藥集團制藥總廠;銀黃膠囊，批號:100101065，重慶陪都藥業(yè)股份有限公司。

1.1.4動物清潔級昆明種小鼠50只，♀♂各半，體質量(20±2)g，動物:微生物控制為SPF級，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，SCXK(軍)字第2002-5號。

1.1.5實驗細菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA(國家細菌耐藥性監(jiān)測中心提供);甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌MSSA標準菌株ATCC29213(購自中國藥品生物制品檢定所)。

1.2方法

1.2.1體外實驗:肉湯稀釋法測MIC 每組排列無菌試管13只，除第1支試管外，每支試管內加MH肉湯2 ml。然后第1、2管中加入2 ml稀釋的極性組分藥液，依次倍比稀釋至第13管(這時藥物最高及最低濃度分別為:乙醇61.0～0.015 g·L－1、氯仿48.0 ～0.012 g·L－1、正丁醇 94.0 ～0.024 g·L－1，水層51.0 ～0.013 g·L－1)。用微量加樣器取0.1 ml MRSA菌液(MRSA過夜培養(yǎng)后0.5麥氏比濁，再用M-H肉湯1∶10稀釋，使之含量1010個·L－1)依次由低濃度到高濃度，最終接種菌量為5×108個·L－1。另取兩支試管，做“肉湯對照”、“MRSA生長對照”，35℃孵育24h觀察，以肉眼可見生長判定最低有效濃度MIC(minimal inhibitory concentration，MIC)。

1.2.2體內實驗:感染小鼠保護實驗① 感染菌液制備:將MRSA于實驗前1 d接種于2 ml M-H肉湯中，35℃培養(yǎng)6 h，取菌液0.1 ml轉接于10 ml肉湯中，35℃培養(yǎng)18 h，為增毒原菌液。于臨用前，0.5麥氏比濁再適當稀釋后用體積分數為0.05的mucin(以1份菌液與9份mucin混合)稀釋至感染動物LD90所需的終濃度［8］。② 實驗動物分組:前述小鼠♀♂各半，分別隨機分成5組:感染模型對照組、藍玉簪龍膽水煎液高、中、低劑量組，銀黃膠囊陽性對照組，每組10只。③ 方法:每只小鼠腹腔注射0.5 ml感染菌液，隨后分組給藥，藍玉簪龍膽水煎液組 4 g·kg－1［6］(原藥)灌胃給藥 0.5 ml，高劑量組每天4次，中劑量組每天3次，低劑量組每天2次;銀黃膠囊陽性對照組灌胃給藥0.75 g·kg－1，每天4次。逐日觀察并記錄感染小鼠存活數量，共15 d。之所以用銀黃膠囊做陽性對照，是因為沒有明確的用于MRSA的中草藥，銀黃膠囊由黃芩、金銀花配方而成，在以往的體外研究中這兩種草藥均有很好的抗MRSA作用［9］。此外，在之前預實驗中做過單獨mucin注射對照，小鼠無死亡。

1.3統(tǒng)計學處理記錄小鼠死亡或存活情況進行χ2檢驗判斷。

2 結果

2.1體外抗菌作用肉湯稀釋法結果發(fā)現(xiàn)，藍玉簪龍膽各極性組分對MRSA和MSSA均有體外抗菌作用。結果見Tab 1。

Tab 1 In vitro antibacterial test(MIC/g·L－1)

藍玉簪龍膽的各提取物對MRSA和MSSA的敏感性差異無顯著性，可能是由于中草藥在機體內的抗菌活性有別于抗生素［9］。其中，正丁醇組分的MIC值在各極性組分中最低，即有效濃度最低。

2.2藍玉簪龍膽水煎液對小鼠腹腔耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的作用小鼠腹腔感染2 h后出現(xiàn)畏寒、寒戰(zhàn)，10 h后眼睛有膿性物質分泌，活動減少，無進食，20 h后出現(xiàn)腹瀉、體溫降低等癥狀，并開始死亡。死亡小鼠尸檢，各組小鼠的肝、腎均出現(xiàn)不同程度膿點，其他臟器未見異常。無菌操作取存活及死亡小鼠的心血，接種于瓊脂平板，35℃孵育，24 h后存活小鼠的心血培養(yǎng)無菌落，死亡小鼠的心血均有菌落生長。治療15d后結果見Tab 2，中劑量組與對照組相比較差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 2 Protective effect of Gentiana veitchiorum Hemel on mice infected with MRSA(n=15)

3 討論

在耐藥菌大量涌現(xiàn)的情況下，我國傳統(tǒng)中草藥并沒有出現(xiàn)明顯的耐藥情況，有研究者認為中草藥除直接的抗菌作用外，還可增強機體的免疫力，有其獨特機制［10－11］，這些可能是中草藥不易產生耐藥性的原因。本實驗從體內、體外兩部分證實了藍玉簪龍膽的抗菌作用。體外肉湯稀釋法顯示，藍玉簪龍膽各極性組分存在抑菌差異，由于苷類物質較易溶于正丁醇，生物堿較易溶于乙醇、氯仿，由實驗結果推測藍玉簪龍膽發(fā)揮抑菌作用的有效物質可能為苷類或生物堿，為該藥有效成分分析做參考。感染動物實驗顯示，藍玉簪龍膽各治療組比對照組小鼠的癥狀稍輕、發(fā)病緩、恢復快，就死亡小鼠而言，有效延長死亡時間1～2 d。但在此實驗中，高劑量組死亡率高于中劑量組，雖然藍玉簪龍膽在之前的急毒、長毒實驗中，均未出現(xiàn)毒副作用，但是對于感染小鼠，說明此藥并非劑量越大療效越好。對于銀黃膠囊組，主成分黃芩、金銀花，雖在體外抗MRSA研究中取得很好效果，但本次體內用藥只是參考臨床治療上呼吸道疾病的用量，可能對于抗MRSA劑量還需調整，所以本次銀黃膠囊的治療不理想。

清熱解毒中藥常用于治療感染性疾病，但體外抑菌實驗效果差異較大，有些與抗生素聯(lián)用往往能增強抗生素的殺菌療效［12］。體外研究結果進一步促進了清熱解毒中藥的臨床研究和應用，形成了中藥“抗菌增敏”的概念［13－14］。藍玉簪龍膽作為單方制劑，對于急癥感染作用還是很明顯的，本研究為臨床控制MRSA感染提供了新思路。

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