烏司他丁上調(diào)水通道蛋白1保護(hù)新生豬體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷

榮 健，葉 升，肖亮燦，郭俊英，梁孟亞，劉 海，黃偉明，吳鐘凱

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.麻醉科、2.腫瘤科、3.心臟外科，廣東 廣州 510000)

肺缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)引起的肺功能障礙，是體外循環(huán)心臟手術(shù)后最常見的并發(fā)癥和導(dǎo)致死亡的主要原因之一［1］。由于未成熟肺組織的特殊解剖生理學(xué)特點(diǎn)，使其在體外循環(huán)期間更易于受到損傷［2］。烏司他丁(ulinastatin，UTI)是從男性尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑，有很強(qiáng)的抑制水解酶的作用，能改善休克時的循環(huán)狀態(tài)、對溶酶體膜起穩(wěn)定作用、抑制炎癥介質(zhì)的釋放等功能，對內(nèi)毒素引起的肺損傷具有保護(hù)作用［3］，但其可能的機(jī)制尚未不清楚。水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是近年來的研究熱點(diǎn)之一，它選擇性地分布在與體液吸收或分泌有關(guān)的上皮細(xì)胞及可能協(xié)同液體跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞中，執(zhí)行著各部位的水分重吸收、液體分泌和細(xì)胞內(nèi)外水平衡功能。AQPs有多種亞型，目前研究較多的水通道蛋白1(AQP1)具有清除支氣管和脈管周圍組織水分的作用［4］。研究表明，AQP1 參與腺病毒［5］、LPS［6］和高氧性［7］肺損傷中的病理性肺水腫過程。但在體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷中的作用未見報(bào)道。本研究采用新生豬體外循環(huán)模型，觀察烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺缺血/再灌注后AQP1的影響，以期從分子水平探討烏司他丁肺保護(hù)機(jī)制，尋求抑制體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物平均體質(zhì)量4.9(S=0.6)kg，年齡＜1月的健康新生五指山小香豬12只(廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所提供)，♀♂不限，依據(jù)主動脈開放前是否經(jīng)肺動脈給予烏司他丁，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組在主動脈開放前通過肺動脈注射烏司他丁10 000 U·kg－1。

1.2麻醉方法及手術(shù)過程肌肉注射氯胺酮40 mg·kg－1和芬太尼 2 μg·kg－1，靜脈注射維庫溴銨0.1 mg·kg－1行氣管插管，呼吸機(jī)維持機(jī)械呼吸(潮氣量 13 ～15 ml·kg－1，呼吸頻率12 ～16 次/分)，股動、靜脈分別插管測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)及中心靜脈壓(central venous pressure，CVP)。胸骨正中劈開，切開心包，右心房內(nèi)注射肝素3 mg·kg－1，主動脈和上下腔靜脈分別插入10F和12F插管，連接人工心肺機(jī)。升主動脈根部插入并固定16號針頭，連接灌注裝置。采用3M人工心肺機(jī)，polystan safe micro膜肺，Sarns變溫水箱以及東莞科威醫(yī)療儀器廠的塑料管道。兩組均以羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液預(yù)充，預(yù)充總量(110±23)ml。

1.3CPB管理兩組新生豬CPB開始后，維持流量180 ～220 ml·(min·kg)－1，并體循環(huán) 10 min，阻斷升主動脈后在主動脈根部灌注4℃改良 ST.Tomas停跳液 15 ml·kg－1，阻斷升主動脈60 min后開放升主動脈，開放后輔助循環(huán)90 min。開放主動脈后如心臟出現(xiàn)室顫者使用交流電除顫復(fù)跳。

1.4標(biāo)本采集及檢測指標(biāo)在開胸后即刻(T1)、主動脈開放90 min實(shí)驗(yàn)結(jié)束前(T2)分別留取標(biāo)本。通過奧林巴斯纖維支氣管鏡向右肺中葉注入生理鹽水10 ml后負(fù)壓6.65～13.3 kPa吸引，灌注4次，灌注液總量為40 ml，回收率＞40%為有效。所取肺灌洗液即刻以1 000 r·min－1離心 10 min，上清液－70℃保存。左下肺組織部分以3.33 mol·L－1中性甲醛固定，部分－80℃ ～－70℃保存。肺靜脈血上清液－80℃ ～－70℃保存。肺組織進(jìn)行HE染色，石蠟切片，光鏡下觀察病理變化。將肺泡灌洗液離心所得沉淀用0.5 PBS液懸浮，取10 μl在玻片上制成直徑約1 cm的細(xì)胞涂片，瑞氏－姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)全片中性粒細(xì)胞(PMN)，按標(biāo)準(zhǔn)體積換算濃度。ELISA法(美國MDI公司)測定肺靜脈血上清液IL-6和TNF-α含量。肺組織于4℃生理鹽水中漂洗，剔除結(jié)締組織，濾紙吸干表面水分，分析天平稱濕重，然后置80℃溫箱內(nèi)，48 h后稱干重，計(jì)算 W/D。免疫組化采用濃縮型兔抗羊AQP1多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)及超敏即用型S2P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(Maxim Biotech.Inc)。AQP1相關(guān)抗原以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞核和胞質(zhì)內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行圖像半量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，評價指標(biāo)采用AQP1累計(jì)光密度率(IOD率，the percentage of integrated optical density)，即AQP1累計(jì)光密度與視野實(shí)質(zhì)累計(jì)光密度的比率。以每例5個視野的平均AQP1累計(jì)光密度率作為該例的測量值。提取肺組織總蛋白，Western blot檢測肺組織AQP1蛋白表達(dá)，以β-actin蛋白表達(dá)做為內(nèi)參，成像系統(tǒng)進(jìn)行分析和掃描，結(jié)果以光密度比值表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量數(shù)據(jù)運(yùn)用±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述分析，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)運(yùn)用百分位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述分析。為檢驗(yàn)組間差異，對計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)(discrete variable)組間比較，采用兩個獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(two independent samples tests);對計(jì)量數(shù)據(jù)(measurement data)，采用兩樣本t檢驗(yàn)(independent samplesttest)。對重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析(repeated measures analysis of variance)。

2 結(jié)果

2.1烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注后90 min肺組織病理變化(HE染色)的影響兩組豬肺組織在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時均出現(xiàn)炎性細(xì)胞滲出、肺間質(zhì)水腫、肺間隔增厚、肺泡融合等病理改變，但實(shí)驗(yàn)組組織病理學(xué)損傷程度相對較輕。依據(jù)半定量方法［8］對肺損傷進(jìn)行5級分類:0:無損傷;1:輕度損傷;2:中度損傷;3:嚴(yán)重?fù)p傷。400倍光鏡下任取10個視野，計(jì)算平均每個視野所得分均值代表損傷程度。組間比較，T2時點(diǎn)兩組肺損傷評分:(1.4±0.20vs2.8±0.11，實(shí)驗(yàn)組vs對照組)，P＜0.05。見Fig 1。

Fig 1 Lung injury of two groups by HE staining (×400)

2.2烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注后90 min肺泡灌洗液中PMN計(jì)數(shù)兩組肺泡灌洗液PMN基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，再灌注90 min兩組均上升，但實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組，P＜0.05，見 Fig 2。

2.3烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺靜脈血IL-6和TNF-α含量的影響兩組新生豬肺靜脈血漿IL-6和TNF-α含量基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。T2時點(diǎn)組間比較，實(shí)驗(yàn)組IL-6和TNF-α含量明顯低于對照組，P＜0.05，見Fig 3。

Fig 2 PMN in BALF of two groups

Fig 3 IL-6 and TNF-α of two groups(±s)

Tab 1 W/D weight of two groups(±s，n=6)

Tab 1 W/D weight of two groups(±s，n=6)

T1:after anesthesia;T2:90 min after declamping.*P ＜0.05 vs between two groups;△P ＜0.05 vs T1 in group.

Time W/D weight Control Test T1 4.8 ±0.3 4.3 ±0.4 T2 7.5 ±0.4△ 5.1 ±0.3*

2.4烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺組織濕干比重(W/D)的影響兩組相比，兩組W/D基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組W/D在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)均與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見Tab 1。2.5烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注后90 min AQP1的影響AQP1陽性染色呈現(xiàn)深棕黃色。可見AQP1主要分布于肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮。與對照組相應(yīng)時點(diǎn)比較，實(shí)驗(yàn)組在T2時點(diǎn)AQP1染色較濃密，提示表達(dá)上調(diào)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0分析，實(shí)驗(yàn)組AQP1累計(jì)光密度率(IOD率，AQP1累計(jì)光密度與視野實(shí)質(zhì)累計(jì)光密度的比率)在實(shí)驗(yàn)組 T2明顯高于對照組，36.05%vs18.2%，P＜0.05，見 Fig 4。Western blot檢測 AQP1蛋白表達(dá)表現(xiàn)出相同的趨勢，實(shí)驗(yàn)組T2 AQP1表達(dá)明顯高于對照組T2，P＜0.05，見Fig 5。

Fig 4 Expression of AQP1 by immunohistochemistry(×400)

Fig 5 Western blot analysis(B)for AQP1 expression in pulmonary tissue from pig

3 討論

3.1烏司他丁對新生豬體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用肺缺血/再灌注引起的肺損傷是臨床體外循環(huán)術(shù)后最主要的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高達(dá)15% ～30%［1］。再灌注后氧供突然增加，機(jī)體產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物;同時更多的炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子在原來體外循環(huán)本身引起的炎性反應(yīng)的基礎(chǔ)上進(jìn)入循環(huán)，引起嚴(yán)重的正反饋性全身性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致器官損傷［9］。未成熟肺臟容量小;功能殘氣量(FRC)相對較少;肺泡/體表面積比明顯小于成人;肺血管內(nèi)皮通透性較高，存在通氣/血流比失調(diào)和肺內(nèi)分流;肺表面活性物質(zhì)合成及儲備較低［10］，這些生理特點(diǎn)使其在體外循環(huán)期間更易于受到損傷［2］。絲氨酸蛋白酶抑制劑烏司他丁是一種內(nèi)源性抗侵襲物質(zhì)，可抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)的多個環(huán)節(jié)，具有防治肺損傷的功效［11］。本實(shí)驗(yàn)對照組中，反映肺組織損傷的HE染色觀察結(jié)果，反映肺組織白細(xì)胞浸潤的肺泡灌洗液中PMN計(jì)數(shù)、炎癥級聯(lián)反應(yīng)中的主要炎性介質(zhì)TNF-α、反應(yīng)組織損傷程度的敏感指標(biāo)IL-6和肺組織含水指標(biāo)W/D在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時明顯增加，表明體外循環(huán)新生豬發(fā)生了缺血/再灌注損傷。給予烏司他丁可以明顯改善上述指標(biāo)，說明烏司他丁有效抑制了體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷引起的肺通透性增強(qiáng)、肺水腫形成和白細(xì)胞浸潤，具有一定的肺保護(hù)作用，與其他研究結(jié)果［10］相符。

3.2AQP1與新生豬體外循環(huán)肺缺血/再灌注早期損傷AQPs又稱水孔蛋白，是細(xì)胞膜上一種與水的通透性有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。自從1991年被發(fā)現(xiàn)［12］，迄今為止共有200余種 AQPs在不同物種中被發(fā)現(xiàn)。肺內(nèi)AQP1主要分布于肺血管內(nèi)皮。AQP1減輕急性肺損傷中的通透性肺水腫［5－6］，AQP1敲除小鼠肺血管內(nèi)皮通透性降低10倍，從而導(dǎo)致嚴(yán)重肺水腫［13］。皮質(zhì)類固醇可促進(jìn)AQP1表達(dá)，從而減輕肺水腫［14］。AQP1是否參與體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷以及烏司他丁肺保護(hù)作用是否與AQP1有關(guān)均未見報(bào)道。

我們在豬體外循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，對照組AQP1蛋白表達(dá)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時明顯升高，表明在再灌注期有AQP1合成過程，提示AQP1參與了體外循環(huán)肺缺血/再灌注早期損傷的機(jī)體自身的保護(hù)過程。在實(shí)驗(yàn)組中給予烏司他丁，AQP1的表達(dá)較對照組明顯增高，下游的IL-6和 TNF-α也較對照組降低。提示烏司他丁不僅具有體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷保護(hù)作用，而且其可能的機(jī)制是通過促進(jìn)AQP1合成實(shí)現(xiàn)的。

由于大動物模型的限制，本實(shí)驗(yàn)不能通過阻斷途徑反向驗(yàn)證AQP1在體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷中的確切機(jī)制。雖然APQ1與AQP5在肺泡腔與毛細(xì)血管之間水分子的運(yùn)轉(zhuǎn)具有同等重要的作用，但AQP5主要分布于肺泡I型細(xì)胞上不易鑒別，并且有研究表明在新生鼠中AQP5表達(dá)非常低微［15］，因此本實(shí)驗(yàn)未對AQP5進(jìn)行探討。

3.3烏司他丁的肺保護(hù)作用模型探討雖然眾多研究均顯示烏司他丁具有肺保護(hù)作用，但在體外循環(huán)肺缺血/再灌注早期損傷中的作用未見報(bào)道。大部分研究關(guān)注于烏司他丁對體外循環(huán)本身引起的全身炎性反應(yīng)中肺部表現(xiàn)的保護(hù)。由于體外循環(huán)肺缺血/再灌注損傷，屬于不完全性肺缺血/再灌注損傷［16］，因此其導(dǎo)致的肺損傷不能等同于體外循環(huán)本身引起的肺部損傷。因此本實(shí)驗(yàn)選擇主動脈開放前通過肺動脈注射烏司他丁。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此種方法具有肺缺血/再灌注損傷保護(hù)作用。

3.4小結(jié)烏司他丁對新生豬體外循環(huán)缺血/再灌注導(dǎo)致的肺損傷具有一定的保護(hù)作用，可能的作用機(jī)制與其促進(jìn)AQP1合成有關(guān)。提示未來可針對AQP1阻斷途徑進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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