八肽膽囊收縮素通過(guò)p38 MAPK通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)

倪志宇，叢 斌，董 玫，馬春玲，李淑瑾，付麗紅，張曉靜，文 迪，徐之璐

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理及病理過(guò)程，p38 MAPK是控制炎癥反應(yīng)最主要的MAPK家族成員之一［1］。在許多重癥疾病如膿毒癥、ARDS、嚴(yán)重?zé)齻?、急性胰腺炎中均可檢測(cè)到p38 MAPK的激活，大量研究表明阻斷p38級(jí)聯(lián)能減輕炎癥反應(yīng)［2］。

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)屬小分子肽類物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)機(jī)能活動(dòng)。研究表明，CCK-8具有抗內(nèi)毒素休克(endotoxin shock，ES)作用。在ES大鼠肺組織及大鼠肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞(pulmonary interstitial macrophages，PIMs)，CCK-8 可通過(guò)激活cAMP-PKA 信號(hào)通路［3］，抑制 PKC 通路［4－5］而抑制NF-κB 的活性［6］，從而抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)［7］，發(fā)揮抗ES作用。但CCK-8是否通過(guò)p38 MAPK通路調(diào)控炎癥反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將觀察CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞 IL-1β表達(dá)的影響及p38 MAPK在CCK-8調(diào)控LPS誘導(dǎo)IL-1β表達(dá)中的作用，以進(jìn)一步闡明CCK-8的抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料RAW264.7細(xì)胞(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué))、大腸桿菌脂多糖(LPS E.Coli 0111:B4)、八肽膽囊收縮素、p38 MAPK特異性抑制劑SB203580(美國(guó)Sigma公司);小鼠單克隆磷酸化p38抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);HRP-羊抗小鼠IgG(北京中山公司);小鼠IL-1β ELISA Kit(法國(guó)Diaclone公司);TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司);AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司);Taq DNA聚合酶(上海Sangon公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組RAW264.7細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每瓶1×107細(xì)胞，加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基及不同處理因素，孵育細(xì)胞。分組:① LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn):細(xì)胞培養(yǎng)基中加入LPS(1 mg·L－1)，分別孵育不同時(shí)間(0、3、6、12、24 h);②不同濃度CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)及p38 MAPK活化的影響:對(duì)照組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的生理鹽水;LPS組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入LPS(1 mg·L－1);LPS+CCK-8組:細(xì)胞培養(yǎng)基中先加入 CCK-8(10－10、10－8、10－6mol·L－1)，孵育10 min 后加入 LPS(1 mg·L－1);LPS+SB203580組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 SB203580(10 μmol·L－1)，孵育30 min 后加入 LPS(1 mg·L－1);LPS+SB203580+CCK-8組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入SB203580(10 μmol·L－1)，孵育 30 min 后加入CCK-8(10－8mol·L－1)，孵育 10 min 后加入 LPS(1 mg·L－1);CCK-8組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 CCK-8(10－8mol·L－1);SB203580 組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入SB203580(10 μmol·L－1);CCK-8+SB 組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 SB203580(10 μmol·L－1)，孵育 30 min后加入CCK-8(10－8mol·L－1)。以上各組分別孵育不同時(shí)間后檢測(cè)細(xì)胞IL-1β(6 h)、IL-1β mRNA(3 h)、p38 MAPK(30 min)的表達(dá)。

1.3ELISA法檢測(cè)IL-1β的表達(dá)使用ELISA試劑盒分析細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β濃度。

1.4RT-PCR法檢測(cè)IL-1βmRNA表達(dá)利用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。取4.0 μg總RNA，65℃變性5 min，經(jīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA產(chǎn)物，依次加入10×PCR緩沖液，上、下游引物 50 pmol，dNTP 0.2 mmol·L－1，MgCl22.0 mmol·L－1，Taq DNA polymerase 1 U，以下列條件進(jìn)行擴(kuò)增:94℃ 3 min;94℃ 45 s;52℃ 45 s(IL-1β)，55℃ 45 s(β-actin);72℃ 45 s。進(jìn)行30次循環(huán)后進(jìn)一步延伸72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳。引物由上海生工公司合成。序列如下:IL-1β(上游5'-GCTTCAGGCAGGCAGTAT-3'，下 游 5'-ACAAACCGCTTTTCCATCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物475 bp)，β-actin(上游5'-CTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，下游 5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物218 bp)。用Gel-pro凝膠分析軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行半定量分析，用任意單位(AU)表示凝膠譜帶的面積×熒光強(qiáng)度值，各細(xì)胞因子與β-actin的AU比值代表各mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.5Western blot法檢測(cè)p-p38 MAPK表達(dá)將各組細(xì)胞提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量后，電印跡轉(zhuǎn)移法將凝膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。加入p-p38小鼠單克隆抗體(稀釋度1∶80)，4℃孵育過(guò)夜，TBS洗膜3次，加入 HRP標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶1 000)，37℃孵育1 h，TBS洗膜后，化學(xué)發(fā)光法顯色。使用成像分析系統(tǒng)對(duì)顯色條帶進(jìn)行光密度分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用±s表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞mRNA水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β含量隨LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，分別于LPS刺激后3 h及6 h達(dá)到高峰，與其他時(shí)間點(diǎn)相比差異均有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)，見(jiàn)Tab 1，F(xiàn)ig 1。

Tab 1 The production of IL-1β in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s，n=3)

Tab 1 The production of IL-1β in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s，n=3)

△△P＜0.01 vs LPS 0 h;＊＊P ＜0.01 vs LPS 6 h;▲P ＜0.05 ，▲▲P＜0.01 vs LPS 3 h

Group IL-1β(ng·L－1)IL-1β mRNA(IL-1β/β-actin ratio)LPS 0 h 0.00 ±0.00 0.000 ±0.000 3 h 34.11 ±4.83△△＊＊ 0.723 ±0.030△△6 h 209.41 ±10.04△△ 0.665 ±0.015△△▲12 h 106.48 ±8.36△△＊＊ 0.366 ±0.035△△▲▲24 h 74.32 ±7.37△△＊＊ 0.211 ±0.020△△▲▲

Fig 1 The expression of LPS-induced IL-1β mRNA in RAW264.7 cells for different time

2.2不同劑量CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響1 mg·L－1LPS孵育RAW264.7細(xì)胞6 h(3 h)，細(xì)胞上清中IL-1β含量(細(xì)胞IL-1β mRNA水平)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。10－10mol·L－1CCK-8 對(duì) LPS誘導(dǎo)的 IL-1β生成無(wú)影響，10－8、10－6mol·L－1CCK-8 可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β生成，和LPS組相比抑制率分別為 50.7%、82.2%(IL-1β含量)及 50.5%、72.5%(IL-1β mRNA)(P＜0.01)，見(jiàn) Tab 2，F(xiàn)ig 2。

Fig 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1βmRNA expression in RAW264.7 cells

Tab 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and p-p38 MAPK expression in RAW264.7 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and p-p38 MAPK expression in RAW264.7 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control;▲P＞0.05，▲▲P＜0.01 vs LPS

Group IL-1β(ng·L －1)IL-1β mRNA(IL-1β/β-actin ratio)p-p38 MAPK(p-p38 MAPK/β-actin ratio)Control 0.00 ±0.00 0.000 ±0.000 0.114 ±0.021 LPS 209.41 ±10.04＊＊ 0.728 ±0.044＊＊ 1.177 ±0.090＊＊LPS+CCK-8 10－10mol·L－1 202.98 ±9.65＊＊▲ 0.718 ±0.044＊＊▲ 1.194 ±0.061＊＊▲LPS+CCK-8 10－8mol·L－1 103.26±12.14＊＊▲▲ 0.360±0.040＊＊▲▲ 0.633 ±0.606＊＊▲▲LPS+CCK-8 10－6mol·L－1 37.32±7.37＊＊▲▲ 0.200±0.013＊＊▲▲ 0.320 ±0.026＊＊▲▲CCK-8 10 －8mol·L －10.00 ±0.00 0.000 ±0.000 0.083 ±0.017

2.3不同劑量CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞p38 MAPK活性的影響對(duì)照組及CCK-8組RAW264.7細(xì)胞p-p38 MAPK水平較低，LPS刺激30 min可使細(xì)胞 p-p38 MAPK水平明顯升高，較對(duì)照組相比增加了約9.32倍(P＜0.01)。10－10mol·L－1CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的 p-p38 MAPK水平無(wú)明顯影響，10－8、10－6mol·L－1CCK-8 劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的p-p38 MAPK水平，抑制率分別為44.1%和71.9%(P＜0.01)，但 p-p38 MAPK水平仍高于對(duì)照組(P＜0.01)，見(jiàn)Tab 2，F(xiàn)ig 3。

Fig 3 Effects of CCK-8 on p-p38 MAPK expression in LPS-induced RAW264.7 cells

2.4p38 MAPK在CCK-8調(diào)控LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)中的作用對(duì)照組、CCK-8組、SB組及CCK-8+SB組均未檢測(cè)到IL-1β及其mRNA的表達(dá)。1 mg·L－1LPS誘導(dǎo)了IL-1β及其 mRNA 的表達(dá)(P＜0.01)。10－8mol·L－1CCK-8抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-1β及其mRNA表達(dá)，抑制率為分別為50.6%和47.7%(P＜0.01)。10 μmol·L－1SB203580抑制了 IL-1β 及其 mRNA表達(dá)，抑制率分別為57.3%及56.7%(P＜0.01)。10 μmol·L－1SB203580 與 10－8mol·L－1CCK-8 共同作用進(jìn)一步抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-1β及其mRNA表達(dá)，抑制率分別77.6%和78.4%(P＜0.01vsLPS組、LPS+SB 組、LPS+CCK-8 組)，見(jiàn) Tab 3，F(xiàn)ig 4。

3 討論

在參與炎癥反應(yīng)的眾多介質(zhì)中，最有影響的是TNF-α、IL-1β等，與內(nèi)毒素休克發(fā)病和死亡的關(guān)系也最為密切［7－8］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可迅速誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β及其mRNA的表達(dá)，而預(yù)先給予CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β及其mRNA的表達(dá)。說(shuō)明CCK-8通過(guò)抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)參與機(jī)體抗炎反應(yīng)過(guò)程，且CCK-8對(duì)細(xì)胞因子生成的調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。這與本室報(bào)道CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠PIMs TNF-α［6］、IL-1β［7］表達(dá)的結(jié)果一致。

Tab 3 Effects of CCK-8 and SB203580 co-incubation on IL-1β production in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

Tab 3 Effects of CCK-8 and SB203580 co-incubation on IL-1β production in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control;▲▲P＜0.01 vs LPS;△△P＜0.01 vs LPS+CCK-8 and LPS+SB

0.00 ±0.00 0.000 ±0.000

Fig 4 Effects of CCK-8 and SB203580 co-incubation on IL-1β mRNA expression in LPS-induced RAW264.7 cells

MAPK是介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞核反應(yīng)的極其重要的信號(hào)系統(tǒng)，已證明在哺乳動(dòng)物中存在4個(gè)MAPK成員，即 ERK、JNK/SAPK、p38和 ERK5/BMK1等MAPK亞族，其中p38 MAPK通路主要對(duì)炎性細(xì)胞因子和多種類型的細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，大量研究表明阻斷 p38級(jí)聯(lián)能減輕炎癥反應(yīng)［1－2］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 迅速誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞p38 MAPK的激活，而CCK-8則濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的p38 MAPK的活化，說(shuō)明CCK-8發(fā)揮抗炎作用是通過(guò)抑制p38 MAPK的活化完成的。

為進(jìn)一步明確p38 MAPK在CCK-8調(diào)控LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)中的作用，我們又觀察了p38 MAPK特異性抑制劑 SB203580和CCK-8共同作用對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞 IL-1β 表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L－1SB203580抑制了LPS誘導(dǎo)的p38 MAPK的活化，抑制率為87.2%，接近至未刺激水平;但10 μmol·L－1SB203580僅抑制了約57.3%IL-1β及56.7%IL-1β mRNA表達(dá)，說(shuō)明還有p38 MAPK之外的其他通路調(diào)控IL-1β的表達(dá)，這與多數(shù)學(xué)者證實(shí)的多條通路調(diào)控IL-1β表達(dá)的研究結(jié)果一致。而加入CCK-8后進(jìn)一步抑制了 LPS誘導(dǎo)的IL-1β及其IL-1β mRNA的表達(dá)(分別抑制了約77.6%及78.4%)，說(shuō)明CCK-8通過(guò)抑制p38 MAPK的激活以及p38 MAPK以外的其他通路抑制IL-1β的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)。我室多項(xiàng)研究證實(shí)，CCK-8可抑制 ES大鼠 PIMs CD14［9］及TLR4［10］的表達(dá)、抑制 PKC 活性［5］及 NF-κB［6］、AP-1(數(shù)據(jù)未發(fā)表)的DNA結(jié)合活性，從而抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)而發(fā)揮抗ES作用。已知在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，LPS與其受體CD14、TLR4結(jié)合，將LPS信號(hào)由細(xì)胞外傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)一系列信號(hào)通路使NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子激活，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)［11］。而CCK-8則可通過(guò)抑制信號(hào)通路中 CD14、TLR4、PKC、p38 MAPK、NF-κB、AP-1 等多層次、多靶點(diǎn)調(diào)控TNF-α、IL-1β等炎性介質(zhì)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。提示我們?cè)谝恍┘甭匝装Y相關(guān)性疾病的治療中，CCK-8可能是一種潛在有效的治療因子。

以往有關(guān)CCK-8與p38 MAPK的研究多針對(duì)急性胰腺炎，并證實(shí)，CCK-8通過(guò)激活p38 MAPK參與急性胰腺炎的發(fā)病過(guò)程。但CCK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有細(xì)胞及組織特異性。Meng等［12］發(fā)現(xiàn)，CCK-8可激活ES大鼠肺組織及脾組織p38 MAPK并抑制了肺組織TNF-α水平。本室已證實(shí)，CCK-8可抑制TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞株RSC-364 p38 MAPK活性［13］。因此，CCK-8在不同組織和細(xì)胞對(duì) p38 MAPK的調(diào)控尚需進(jìn)一步研究。

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