載脂蛋白A5基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究

03000 山西太原解放軍6醫(yī)院 陳毓徐麗萍張峻青

066100 北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院 李榮3

載脂蛋白A5基因 (apolipoprotein A5 gene，ApoA5)是2001年分別由Pennacchio和Vliet兩個(gè)研究小組通過比較小鼠與人的基因組DNA而發(fā)現(xiàn)的一種新的載脂蛋白基因[1]。它位于11號(hào)染色體長臂23區(qū)的ApoA1/C3/A4基因簇上游30 kb處，基因全長1 889 bp，因其與脂質(zhì)特別是三酰甘油(TG)代謝的關(guān)系密切而成為許多學(xué)者研究的重點(diǎn)。

對(duì)該基因序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)有14個(gè)常見的位點(diǎn)，其中ApoA5-1131T/C基因多態(tài)性對(duì)血漿TG影響較大[2-3]。而血漿TG水平的升高是冠心病(CHD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。因此，我們研究太原地區(qū)漢族人群ApoA5-1131T/C基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)及其與血脂、脂蛋白的相關(guān)性，以期從遺傳學(xué)角度探討ApoA5基因變異與CHD發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 CHD組：太原解放軍264醫(yī)院及太原醫(yī)院住院CHD患者共249例，男153例，女96例；年齡37～87歲，平均年齡(60.5±14.8)歲；所有患者在近日服用降脂藥物，并經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)為CHD。正常對(duì)照組：共176名，男115名，女61名；平均年齡(55.8±13.2)歲；均為門診查體人員，經(jīng)過檢查均排除CHD。兩組患者均除外可能影響血脂的系統(tǒng)性疾病，均無血緣關(guān)系。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指標(biāo)測(cè)定 研究對(duì)象均空腹采血，采用酶比色法測(cè)定血漿膽固醇(TC)、TG含量，采用直接勻相法測(cè)定高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，通過羅氏全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 ApoA5-1131T/C基因型檢測(cè) 取外周血5 mL，用1 mL酸性的枸櫞酸-葡萄糖ACD抗凝，搖勻，用鹽析法抽提DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)ApoA5擴(kuò)增引物：正 向 引 物 5′-GAT TGA TTC AAG ATG CAT TTA GGA C-3′，反向引物5′-CCC CAG GAA CTG GAG CGA AAT T-3′(北京奧科生物技術(shù)有限公司合成)。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性45 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、循環(huán)35次，末次循環(huán)后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MseⅠ(MBI公司)消化過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，在紫外線燈下觀察，判斷結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果均以SPSS 11.0軟件分析。基因型和基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法，研究對(duì)象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，Logistis回歸用來校正年齡、性別、BMI及血清TC、HDL-C、LDL-C水平等其他CHD的發(fā)生相關(guān)因素對(duì)其可能產(chǎn)生的影響。組間血脂水平比較用t檢驗(yàn)，對(duì)CHD組ApoA5基因型與血脂關(guān)系的比較用方差分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，符合正態(tài)分布者進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHD組與對(duì)照組血脂測(cè)定結(jié)果對(duì)比分析(表1) 結(jié)果顯示，CHD組與對(duì)照組比較，TC、HDL-C和LDL-C明顯低于對(duì)照組，而TG則明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 CHD組與對(duì)照組血脂水平測(cè)定結(jié)果(±s)

表1 CHD組與對(duì)照組血脂水平測(cè)定結(jié)果(±s)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

血脂(mmol/L) 對(duì)照組(n=176) CHD組(n=249)TC 4.92±0.88 4.51±1.18*TG 1.26±0.64 2.26±1.83**HDL-C 1.66±0.38 1.12±0.37*LDL-C 2.99±0.79 2.64±0.73*

2.2 ApoA5的基因多態(tài)性分析(圖1) ApoA5基因的PCR擴(kuò)增片段大小為154 bp，Mse I酶切片段有3種：154 bp、133 bp和21 bp。若為TT型，有133 bp、21 bp 2條帶；若為TC型，有154 bp、133 bp、21 bp 3條帶；若為CC型有154 bp 1條帶。由于21 bp的分子量小，游動(dòng)速度快，可能已經(jīng)跑出膠外，圖中沒有顯示。在凝膠電泳中僅出現(xiàn)一條154 bp的CC基因型純合子；一條133 bp和一條154 bp的TC基因型的雜合子；僅出現(xiàn)一條133 bp的TT基因型純合子。

圖1 ApoA5基因多態(tài)性分析

2.3 ApoA5基因型與CHD患者血脂水平的關(guān)系 CHD組ApoA5-1131T＞C的多態(tài)性不同基因型亞組間的血脂水平(表2)，TG水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，即CC組明顯高于TC組、TC組明顯高于TT組。其他血脂指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 CHD組不同基因型血脂水平比較

2.4 ApoA5等位基因和基因頻率的分布(表3) CHD組和對(duì)照組中ApoA5-1131T/C的基因型分布經(jīng)Hardy Weinberg檢驗(yàn)，符合遺傳平衡，具有群體代表性。在測(cè)定的樣本中，以TC較為多見，TT適中，CC較少。等位基因C的頻率在CHD組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

表3 CHD組和對(duì)照組ApoA5-1131T/C基因的基因型和等位基因頻率分布

2.5 ApoA5基因與CHD的相關(guān)性分析 如表3所示，ApoA5的基因型頻率，CHD組與對(duì)照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.76，P=0.012)。CHD組C等位基因頻率明顯低于對(duì)照組(37.1%VS 42.0%，P=0.023)。分析顯示：CC型患CHD的風(fēng)險(xiǎn)是TT型的近3倍。

3 討論

ApoA5基因是通過小鼠基因組序列進(jìn)行比較而找到的，位于11q23染色體上。研究發(fā)現(xiàn)[4]，過度表達(dá)人類ApoA5的基因鼠，其血漿TG水平降低；與野生型對(duì)照鼠比較，ApoA5基因敲除小鼠血漿TG水平上升3倍，這些研究提示，ApoA5是影響血漿TG濃度的重要因素之一。

我們通過對(duì)太原地區(qū)249例CHD患者和176例正常人的ApoA5-1131T/C基因多態(tài)性與血脂水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CHD組ApoA5-1131T/C的多態(tài)性不同基因型亞組間的TG水平呈顯著性差異(P＜0.01)，即CC組明顯高于TC組、TC組明顯高于TT組。CHD組C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，CC型患CHD的風(fēng)險(xiǎn)是TT型的近3倍。本文研究提示，CHD組的血脂水平分析，其中TG和HDL-C的結(jié)果與國內(nèi)外的報(bào)道基本一致，但LDL-C的結(jié)果與其他CHD組的報(bào)道有差異，是否與住院使用降脂藥有關(guān)，有待進(jìn)一步探討?？傊狙芯刻崾咎貐^(qū)漢族人群ApoA5-1131C等位基因存在差異，并且與CHD的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。

近年來對(duì)于ApoA5基因多態(tài)性與心腦血管疾病之間的關(guān)系研究越來越多。Hubacek等發(fā)現(xiàn)ApoA5-1131CC純合子更易發(fā)生心梗[5]；畢楠等報(bào)道ApoA5-1131C等位基因可能與我國北方漢族人CHD的發(fā)生相關(guān)聯(lián)[6]；還有研究認(rèn)為，ApoA5-1131C等位基因不僅與CHD等心腦血管疾病相關(guān)，而且可能是CHD等心腦血管疾病的一個(gè)保護(hù)因素[7]。明確二者的相互關(guān)系及作用機(jī)制，有助于CHD等脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。

[1]Van der Vliet HN，Sammels MG，Leegwater AC，et al.Apoliprotein A-V：a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration[J].J Biol Chem，2001，276(48)：44512-44520.

[2]Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J].Science，2001，294(5540)：169-173.

[3]Pennacchio LA，Rubin EM.Comparativegenomictoolsand databases：providing insights into the human genome[J].J Clin Invest，2003，111(8)：1099-1106.

[4]Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J].Science，2001，294(5540)：169-173.

[5]Hubacek JA，Skodová Z，Adámková V，et al.The influ ence of APOAV polymorphism(T-1131/C and S19/W)on plasma triglyceride levels and risk of myocardial infarction[J].Clin Genet，2004，65(2)：126-130.

[6]畢楠，鄢盛愷，李國平，等.冠心病患者載脂蛋白A5和載脂蛋白C3基因多態(tài)性的研究[J].中華心血管病雜志，2005，33(2)：116-121.