脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白體外誘導(dǎo)hBD-2基因表達(dá)的研究

陳 蕓,劉曉健,趙松蘭

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇鎮(zhèn)江,212000)

近年研究發(fā)現(xiàn),解脲支原體(UU)是女性生殖器感染的重要致病因子,妊娠尤其是晚期妊娠婦女的生理變化有助于UU生長,UU感染可導(dǎo)致胎膜早破(PROM)、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)感染、孕婦產(chǎn)褥期感染等。本研究探討 UU感染的致病因素脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)刺激絨毛膜細(xì)胞與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的hBD-2表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 凍干UU3標(biāo)準(zhǔn)株

由中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 支原體培養(yǎng)

購自珠海麗珠試劑公司。取解脲支原體菌液按1∶10比例接種于固體培養(yǎng)基,在95%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)基顏色由玫瑰紅色轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬?2～4周)后,表示UU已生長至對數(shù)期。傳代2～3次后提取其LAMPs。

1.3 LAMPs提取

LAMPs的提取按照有關(guān)參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。500 mL生長至對數(shù)期的UU培養(yǎng)液于無菌離心管中14 000 r/min離心20 min,棄上清,沉渣經(jīng)PBS洗滌(共洗滌2次),14 000 r/min離心。所得Mg沉渣重懸浮于5 mL含有1 mmol/L EDTA的Tri緩沖鹽液(TBS,50 mmol/L T ris pH 8.0,0.15 mol/L NaCL)當(dāng)中(TBSE)。隨后加入Triton X-114,使其終濃度為2%,4℃靜置1 h,然后置入37℃水浴箱中孵育10 min使其發(fā)生相分離。棄去上層水相,加入等體積TBSE,重復(fù)相分離過程1次。第2次相分離結(jié)束,棄去水相,再加入等體積TBSE恢復(fù)至最初體積。最后加入2.5倍體積無水乙醇,-20℃過夜以沉淀LAMPs。次日于14 000 r/min離心20 min,棄上清,PBS重懸浮LAMPs,超聲處理1～3 min。BCA測定蛋白濃度后置于-80℃?zhèn)溆?。LAMPs在使用前用100 μ g/mL多黏菌素B處理 2 h,以去除提取過程中可能存在的內(nèi)毒素污染。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

取自健康的足月妊娠剖宮產(chǎn)婦女及 UU感染足月妊娠剖宮產(chǎn)婦女各10例,均由江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院產(chǎn)科提供。標(biāo)本采集常規(guī)消毒外陰、陰道,以無菌窺器暴露宮頸,以無菌棉球?qū)m頸揩干凈,再以無菌試子插入宮頸內(nèi)1～2 cm,旋轉(zhuǎn)數(shù)周后停留半分鐘取出,置培養(yǎng)試管中立即送檢。將采集標(biāo)本接種于固體培養(yǎng)基,在95%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)基顏色由玫瑰紅色轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬邽殛栃?培養(yǎng)基未見顏色變化為陰性。

晚孕蛻膜組織及胎盤組織所有標(biāo)本均于剖宮產(chǎn)后按無菌程序操作獲取,標(biāo)本離體后迅速快送實(shí)驗(yàn)室。

蛻膜上皮培養(yǎng)分離純化:蛻膜條件培養(yǎng)液的制備改進(jìn)陳曉等的方法[14],術(shù)中無菌瓶收集標(biāo)本,置于盛有100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的冰生理鹽水中,即刻送進(jìn)實(shí)驗(yàn)室。挑取較厚實(shí)的底蛻膜組織,在冰生理鹽水中反復(fù)吹洗,清除血污。取小片組織剪碎成糊狀(約1 m3大小),加入0.83%NH4Cl進(jìn)一步破除紅細(xì)胞。再加入冰生理鹽水反復(fù)清洗組織懸液數(shù)次,待上清清亮為止。稱取剪切清洗后的蛻膜組織(濕重)300 mg,均勻接種于培養(yǎng)瓶,4 h后加入含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液,次日換成無血清RPMI 1640培養(yǎng)5 mL,收集48 h后的培養(yǎng)上清,4℃,12 000 r/min離心,無菌過濾,-70℃凍干備用。

胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的分離:①將收集的胎盤組織置于DMEM中充分洗滌3次,仔細(xì)去除蛻膜及絨毛基質(zhì),將剩余組織剪碎至1 mm3左右。②加入0.125%胰蛋白酶液十37℃水浴中消化約3 0 min(不予搖晃)。期間隔5 min吸少量消化液鏡下監(jiān)測,適時終止消化。③收集上清液并加10%小牛血清終止消化,100 μ m孔徑金屬篩網(wǎng)過濾,300 g離心10 min。④調(diào)整細(xì)胞密度為6～8×105/mL,種植于MetrigeL包被(MetrigeL:DMEM=1∶2)的塑料培養(yǎng)板或蓋玻片上。

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)液為高糖型條件下培養(yǎng)24 h,DMEM,加入20%胎牛血清,pH值7.0～7.2,于37℃,5%C02除去未貼壁細(xì)胞并換入新鮮培養(yǎng)液。以后每日更換培養(yǎng)液。

傳代培養(yǎng)待原代的細(xì)胞80%匯合后,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗1次,加入1∶1的 0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA(Na)溶液,于37℃消化5～15 min,再加入含20%血清的培養(yǎng)液終止消化,1 000 r/min離心8 min,吹打成單細(xì)胞,以1.0×105/mL接種于新的培養(yǎng)皿培養(yǎng)。傳代細(xì)胞約24 h可貼壁,5～7 d后約有80%聚集長滿。

1.6 LAMPS刺激試驗(yàn)

LAMPS刺激前,蛻膜上皮細(xì)胞及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分別800 rpm離心5 min,棄去培養(yǎng)液,無菌PBS洗滌后,用含有1%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板中調(diào)整其密度為5×105/mL,37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h,隨后于每孔細(xì)胞加入 不同濃度(0 、0.1、1 、2、3 μ g/L)的LAMPS加以刺激,1.5～3 h提取細(xì)胞總 RNA,刺激2～4 h提取細(xì)胞胞質(zhì)蛋白,每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)。

1.7 RT-PCR檢測hBD-2 mRMA表達(dá)

上皮細(xì)胞總RNA的提取采用上海飛捷生物公司的總RNA極速抽提試劑盒,按其說明進(jìn)行。最后用尤RNA酶去離子水溶解RNA沉淀,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank hBD-2cDNA序列(登錄號為NM-004942.2),設(shè)計(jì)特經(jīng)檢查擴(kuò)增片段均跨躍內(nèi)含子hBD-2跨內(nèi)含子引物:上游5′-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3′,下游 5′-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3′,產(chǎn)物長255 bp,符合內(nèi)參照,擴(kuò)增片長度為RT-PCR要求,同時用PCR試劑盒里看家基因GAPDH引物為544 bp。

RT-PCR擴(kuò)增:①RT:取等量(約 2 μ g)總RNA,1 μ L 隨機(jī)引物,dNTP 0.5 mmoL/L,總體積20 μ L,按照RT-PCR試劑盒說明操作。②引物稀釋按引物濃度(mmol/L)=[引物量(mg)/分子量]/體積(L),稀釋引物,使引物終濃度為25 μ mol/L,-20℃保存。③參照《基因擴(kuò)增臨床檢驗(yàn)指南》[15],PCR循環(huán)條件如下:95℃,變性5 min;94℃60 s,62℃30 s,72℃120 s共35個循環(huán),72 ℃延伸5 min,取5 μ L擴(kuò)增液加1 μ L溴酚藍(lán)于2%瓊脂糖凝膠電泳,電壓50 V,電泳40 min,凝膠紫外線下觀察結(jié)果,并攝相。

取誘導(dǎo)因素刺激過的細(xì)胞提取總蛋白,測定蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法,采用SDS-T ricine-PAGE電泳[16-19]hBD-2蛋白,電轉(zhuǎn)印后Western bLotting檢測,出現(xiàn)條帶后,自來水沖洗,觀察、照相。

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測hBD-2表達(dá)用兔抗人hBD-2多克隆抗體(一抗)作免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,二抗為山羊抗兔IgG。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的 LAMPs(0.1～3.0 μ g/mL)能明顯誘導(dǎo)蛻膜上皮細(xì)胞及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生hBD-2,且HBD-2 mRNA表達(dá)與 LAMPs呈明顯的劑量依賴性。

相同濃度的LAMPS刺激蛻膜上皮細(xì)胞及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞,HBD-2 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出時間依賴性。

表1 添加不同濃度LAMPs對絨毛膜細(xì)胞sBD-2基因表達(dá)的影響

表2 添加不同濃度LAMPs對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞sBD-2基因表達(dá)的影響

LAMPs與細(xì)胞內(nèi)sBD-2基因相對表達(dá)量的關(guān)系,用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析表中數(shù)據(jù),在P<0.05水平下,添加不同濃度SPSS12.0,sBD-2基因的相對表達(dá)量均有顯著差異,其中添加LAMPs 3 μ g/mL 與 LAMPs 0.1 μ g/mL 之間差異極顯著,其他濃度與對照組之間差異均顯著,而且2個不同培養(yǎng)時間之間略有差異,此外每個濃度的2個重復(fù)之間也略有差異。結(jié)果表明在較低的濃度下,LAMPs濃度與sBD-2基因相對表達(dá)量變化基本呈正相關(guān)。

HBD-2 mRNA在正常產(chǎn)婦蛻膜及胎盤組織中表達(dá)量較低,而在UU感染的產(chǎn)婦蛻膜及胎盤組織中表達(dá)量明顯升高。

HBD-2的RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示10例UU感染組及10例正常對照組均獲得預(yù)期的137 bp陽性片段,UU感染組HBD-2/β-actin輝度相對值為(0.63±0.09),而對照組HBD-2/β-actin輝度相對值(0.17±0.15),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

經(jīng)典的支原體細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙層和膜蛋白組成,其中膜蛋白可分為2類:一類為膜本體蛋白,另一類外周膜蛋白。膜本體蛋白和外周膜蛋白統(tǒng)稱為脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPS),是暴露在表面與周圍環(huán)境各種成分不斷相互作用因是影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種主要蛋白[1]。該膜蛋可能是介導(dǎo)支原體黏附宿主細(xì)胞表面,進(jìn)入侵宿主細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞受損與死亡的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。因此對支原體LAMPS的研究是了解支原體入侵宿主后與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)鍵。

孕期UU感染與胎膜早破密切相關(guān)[3],而支原體感染者發(fā)生胎膜早破是正常分娩者的8倍[4]。孕婦宮內(nèi)感染UU造成絨毛受損,最終導(dǎo)致妊娠終止,其機(jī)制可能與UU產(chǎn)生的磷脂酶A、C促使細(xì)胞膜中游離的花生四烯酸釋放,而花生四烯酸是前列腺素的必需前體物質(zhì),能損傷胚胎組織及其附屬物而影響妊娠結(jié)局[5]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)UU產(chǎn)生的高分子質(zhì)量物質(zhì)能刺激宿主免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生釋放多種細(xì)胞因子而造成早孕蛻膜的局部免疫損傷[6]。

防御素是一類分質(zhì)量約為4.0～5.0 kMr,含有6個半膚氨酸殘基、二對二硫鍵的陽離子多肽。防御素不僅通過直接殺菌作用抵御入侵機(jī)體的病原微生物,還在介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)過程中起著重要作用[7-8]。防御素2是人體中第1個被發(fā)現(xiàn)的可誘導(dǎo)性防御素,在正常女性陰道、子宮頸、子宮內(nèi)膜、輸卵管、卵巢等5個組織中均有HBD-2 mRNA表達(dá),HBD-2 mRNA在絨毛膜、絨毛及胎盤組織中表達(dá)[9]。防御素2在正常婦女生殖道及妊娠相關(guān)組織中廣泛表達(dá),提示防御素2的基因表達(dá)調(diào)控、生物學(xué)活性對于維系正常婦女及孕婦生殖道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、宿主天然抗感染機(jī)制中起著重要的作用。另有作者提出胎膜的作用不僅是單純的機(jī)械阻擋作用,在體外胎膜有明顯的抗菌活性,在多種細(xì)菌培養(yǎng)皿上,胎膜覆蓋的下方及周圍均有明顯的抑菌圈產(chǎn)生,而作為對照的載薄片無此效應(yīng)[10]。推測胎膜的這種作用可能與防御素的產(chǎn)生有關(guān)。宮頸粘液具有強(qiáng)大而廣譜的抗菌活性,防御素在子宮頸組織中固有表達(dá),可能是子宮頸抗感染作用的重要介質(zhì)[11]。

β-防御素毫摩爾濃度時具有殺傷細(xì)菌的能力,納摩爾濃度時就具有趨化活性。β-防御素具有間接的免疫啟動作用,其可能作為不成熟樹突狀細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的趨化因子,成為先天免疫和后天免疫系統(tǒng)連接的橋梁。在較低的分子濃度下,β-防御素能夠與這些細(xì)胞表面特異性的趨化因子受CCR6相結(jié)合,趨化這些細(xì)胞朝著受致病微生物侵襲的皮膚或粘膜病灶部位遷移,從而提高機(jī)體抵抗微生物感染的獲得性免疫反應(yīng)水平。Becker[12]等對LPS誘導(dǎo)hBD2表達(dá),啟動機(jī)體固有免疫的信號途徑進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)LPS需要一種CD14依賴途徑啟動人支氣管上皮(hTBE)細(xì)胞合成和分泌hBD2,并最終激活NF-κ Bo由此可見,β-防御素在機(jī)體抗微生物入侵的固有性免疫和獲得性免疫中均具有重要作用,防御素作為信號分子在濃度很低時不能直接殺死致病微生物時卻能產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-防御素-2在正常產(chǎn)婦蛻膜及胎盤組織中表達(dá)量較低,而在 Uu感染的產(chǎn)婦蛻膜及胎盤組織中表達(dá)量明顯升高,2者有明顯差異。用不同濃度的LAMPS刺激蛻膜上皮細(xì)胞與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的hBD-2表達(dá)量不一樣,當(dāng)LAMPS的濃度從 0.1～3 μ g/mL,所產(chǎn)生的hBD-2的量逐漸增大,當(dāng)濃度增加到3 μ g/mL時,所產(chǎn)生的hBD-2量最大,HBD-2 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性。相同濃度的LAMPS刺激蛻膜上皮細(xì)胞及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞,HBD-2 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出時間依賴性。Ganz等[13]在純化的防御素對人及小鼠腫瘤的作用中發(fā)現(xiàn),防御素能殺傷多種腫瘤細(xì)胞,特別是對抗腫瘤壞死因子的細(xì)胞系和抗NK細(xì)胞毒因子的細(xì)胞系。它能和靶細(xì)胞膜結(jié)合,引起細(xì)胞骨架易位,從而滅活靶細(xì)胞;同時還發(fā)現(xiàn)其活性由微絲、鈣調(diào)節(jié)蛋白和溶酶體調(diào)節(jié),裂解作用呈劑量和時間依賴性。

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