西紅花酸對AGEs誘導血管內皮細胞通透性增加的抑制作用

向 敏，王建梅，周成華，張雅琴，吳萍萍

(1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院檢驗藥學系，江蘇蘇州 215009;2.蘇州市檢驗醫(yī)學生物技術重點實驗室，江蘇蘇州 215009;3.徐州醫(yī)學院藥理學教研室，江蘇徐州 221004)

內皮細胞(endothelial cells，EC)是分布于血管內膜表面的單層細胞，為一層選擇性半透膜，既保持血流通暢，又可保證血液某些成分進入內皮下間隙，提供血管細胞之所需［1］。正常的內皮細胞具有血管屏障，能舒張血管、抗血栓、抑制平滑肌細胞移行和增生的功能，受損的內皮細胞則相對應地會使血管通透性增加、血栓形成增加、血管收縮、促進平滑肌移行和增生［2］。內皮細胞功能紊亂導致血管內皮通透性增高是糖尿病(diabetic mellitus，DM)血管病變早期標志，也是 DM病變的關鍵環(huán)節(jié)［1］。在DM血管病變時，患者體內高水平AGEs可使血管內皮細胞通透性增加。多種信號通路，包括AGEs受體(RAGE)、氧化應激和p38MAPK可能參與了內皮細胞通透性變化的病理過程。因此，抑制內皮細胞通透性的升高是減慢DM血管病變發(fā)生、發(fā)展的重要措施［3］。

西紅花酸是西紅花的有效組分之一，具有多不飽和共軛烯酸結構，屬于類胡蘿卜素類，具有多種藥理活性作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn):在糖尿病大鼠早期腸系膜血管中，血管內皮通透性增加，導致炎癥細胞等浸潤至血管內皮下層，促發(fā)炎癥反應，加速血管病變的進程，而西紅花酸能保護DM大鼠腸系膜血管，抑制病變發(fā)生進程［4］。體外實驗發(fā)現(xiàn)，西紅花酸能抑制AGEs誘導的白細胞(單核細胞/中性粒細胞)與內皮細胞的黏附作用，維護內皮細胞正常的功能［5-7］。本研究將觀察西紅花酸是否具有抑制AGEs誘導內皮細胞通透性增高的作用，這種抑制作用是否與其影響應激敏感通路p38MAPK有關，從內皮細胞的細胞通透性調節(jié)角度探討西紅花酸抗DM血管病變的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑西紅花酸(crocetin，中國藥科大學藥理室錢之玉教授提供，HPLC純度為＞99%);葛根素，廣東省大日生物化學藥業(yè)有限公司;DEME培養(yǎng)基，Gibco公司產品;牛血清白蛋白(BSA)，南京生興公司;雙層通透的培養(yǎng)皿(transwell，0.4 μm)，Corning Corstart公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔第二抗體，武漢博士德公司;新生牛血清，HyClone公司;TritonX-100和髓磷脂堿性蛋白(BMP)，Sigma公司;羅丹明-鬼筆環(huán)肽，美國細胞骨架公司;Protein A-Agrose(sc-2001)和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)單抗，Santa Cruz biotechnology，INC;閃爍液，南京醫(yī)科大學同位素實驗室。

1.2主要儀器熒光倒置顯微鏡(尼康公司Ti);全波段酶標儀(Multiskan Spectrum)和CO2培養(yǎng)箱(美國熱電公司);液閃測定儀(Wallac Guardian 1414 liquid scientillation counter)

1.3細胞分離與培養(yǎng)參考文獻方法［6］，用0.5%胰酶消化法分離牛主動脈血管內皮細胞，以含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，直到細胞融合后進行傳代培養(yǎng)，Willebrand因子鑒定表達為陽性，確定為內皮細胞。倒置顯微鏡下可見內皮細胞呈“鵝卵石”狀排列，實驗用第3～8代細胞。

1.4AGEs制備參照文獻方法［7］，將 BSA(5 g·L-1)與d-葡萄糖(50 mmol·L-1)溶于PBS液(內含0.5 mmol·L-1EDTA，pH 7.4)中，充分混勻，無菌過濾，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育3個月后，用透析膜充分透析以去除未結合的d-葡萄糖，0.22 μm濾膜過濾除菌后4℃存放，臨用時稀釋。

1.5西紅花酸對內皮細胞通透性的影響根據文獻方法略加改進用HRP作示蹤劑檢測內皮細胞單層通透性變化［8-9］。實驗分為6組，即正常對照組(control)、AGEs模型組(100 mg·L-1)、葛根素陽性對照組(1 g·L-1)、西紅花酸(0.01、0.1、1 μmol·L-1)組，每組8個復孔，實驗重復2次。將內皮細胞接種在雙層通透的培養(yǎng)皿(transwell，0.4 μm)的小室中，細胞接種密度為3×105/孔，內皮細胞融合成單層時，換成無血清的DMEM培養(yǎng)基，加不同濃度西紅花酸預孵12 h后，去除培養(yǎng)基，用Hank’s液洗滌2遍，再加入DMEM培養(yǎng)液，AGEs組和藥物實驗組分別加入100 mg·L-1AGEs刺激，正常對照組用100 mg·L-1BAS刺激。與內皮細胞共同培養(yǎng)，在不同時間取下室液60 μl與HRP顯色緩沖液860 μl混合，室溫暗處反應 15 min，加入 H2SO43 mol·L-1終止反應，用酶標儀在波長470 nm處測量HRP吸光度以表示內皮細胞單層通透性的變化。

1.6西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞分泌MCP-1和TNF-α的影響選用生長良好的內皮細胞懸液，調整細胞濃度為1×108·L-1，接種于96孔板中。實驗分組同“1.5”，不同劑量西紅花酸預孵12 h，用AGEs(100 mg·L-1)刺激一定時間，取細胞上清，用ELISA試劑盒測定MCP-1和TNF-α含量，每組8個復孔。

1.7西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞后細胞骨架蛋白(F-actin)表達變化參考文獻方法進行［18］。將培養(yǎng)好的內皮細胞，調整濃度為1×108·L-1，加入6孔板中(含經多聚賴氨酸處理過的細胞蓋片)待細胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，加入含0.5%血清培養(yǎng)基使細胞同步化。實驗分組同“1.5”。不同劑量西紅花酸預孵12 h，用AGEs(100 mg·L-1)刺激一定時間后，小心取出蓋片，冷PBS輕洗3遍，冷丙酮固定 15 min，0.1%TritonX-100于 4℃ 處理15min，，羅丹明-鬼筆環(huán)肽(100 nmol·L-1)室溫孵育1 h，冷PBS輕洗3遍，于熒光倒置顯微鏡下，進行紅色熒光檢測。

1.8西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞中磷酸化p38MAPK表達及活性變化參考文獻方法略加改進［10-11］。選用生長良好的內皮細胞懸液(1×108·L-1)，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至融合狀態(tài)，不同濃度的西紅花酸預孵12 h，再換無血清DMEM培養(yǎng)液，AGEs模型組和藥物實驗組分別加入100 mg·L-1AGEs，正常對照組用100 mg·L-1BAS刺激，作用一定時間，用Cell-based ELISA法測定磷酸化p38MAPK蛋白表達。同法將作用好的細胞裂解后，取1 ml細胞裂解液與5 μg特異性p-p38 MAPK抗體于4℃共同孵育1 h，加入20 μl Protein A-Agrose于4℃搖床孵育過夜，4 000 r·min-14℃離心5 min，小心棄上清后，加入1 ml PBS洗滌，4 000 r·min-14℃離心5 min，共4次。棄上清，沉淀下的蛋白加入激酶緩沖(含1 g·L-1MBP及2.96×1011Bq32P-ATP)25 μl，在25 ℃孵育25 min ，取25 μl點于磷酸纖維素濾紙上，室溫5 min，0.5%磷酸緩沖液終止反應后，用PBS徹底沖洗，紅外線烤干，加入2 ml閃爍液過夜后，采用髓磷脂堿性蛋白(MBP)作為p-p38 MAPK反應底物，液體閃爍儀上測定髓磷酸脂堿性蛋白32P的參入量。

1.9統(tǒng)計學處理數(shù)據均以±s表示，用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用F檢驗。

2 結果

2.1西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞通透性的影響由Fig 1可見，100 mg·L-1AGEs刺激內皮細胞后，其通透性隨時間的延長而逐漸增加，作用12 h時，AGEs模型組的通透性與對照組差異有顯著性(P＜0.01)。而用西紅花酸預孵后，內皮細胞通透性雖然與正常對照組相比也有升高，但與AGEs模型組相比，通透性有一定下降(P＜0.01或0.05)，說明西紅花酸有保護內皮細胞的作用。

2.2西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞分泌MCP-1和TNF-α的影響Tab 1可見，AGEs(100 mg·L-1)刺激內皮細胞12 h后，細胞分泌的炎癥因子MCP-1和TNF-α水平較正常對照組上升了3倍左右(P＜0.01)，不同劑量西紅花酸(0.01、0.1、1 μmol·L-1)預孵后，內皮細胞 MCP-1和 TNF-α分泌水平有明顯下降(P＜0.05 or 0.01vsAGEs組)，提示西紅花酸可抑制AGEs誘導內皮細胞的炎癥反應，葛根素也可降低MCP-1和TNF-α水平。

Tab 1 Effect of crocetin on level of MCP-1 and TNF-α in endothelial cells induced by AGEs(n=8)

Fig 1 Effect of crocetin on the hypermeability of endothelial cells induced by AGEs(n=8)

Fig 2 Effect of crocetin on morphological changes of F-actin in endothelial cells induced by AGEs

2.3西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞后細胞骨架蛋白F-actin表達變化F-actin是內皮細胞的主要骨架蛋白之一，主要分布在細胞周邊，呈完整的線條，胞質中未見密集的F-actin纖維，顯示出內皮細胞典型的鵝卵石樣的輪廓，細胞間縫隙連接較緊密，說明正常狀態(tài)時內皮細胞通透性較低;100 mg·L-1AGEs刺激12 h后，部分細胞外周邊緣出現(xiàn)斷裂，溶解，邊界不清晰，有絲狀樣;而西紅花酸(0.1、1 μmol·L-1)預孵后，雖然細胞膜外周邊緣也呈現(xiàn)鋸齒樣變化，但較模型組有明顯改善。提示西紅花酸能抑制AGEs破壞內皮細胞骨架蛋白的作用，從而抑制內皮細胞通透性升高。

2.4西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞中pp38MAPK表達變化100 mg·L-1AGEs與內皮細胞孵育 5、15、30、60、120 min，ELISA 法測定磷酸化p38 MAPK表達。結果顯示:隨時間延長，磷酸化p38 MAPK量增多，30 min時，達到其峰值(P＜0.01)，是基礎水平的近3左右倍，隨后，其表達量迅速下降。該結果表明，AGEs誘導p38 MAPK磷酸化作用是隨時間變化的(Fig 3A)。AGEs與內皮細胞共同培養(yǎng)30 min，使p38-MAPK激酶磷酸化的數(shù)量是對照組的約3倍左右。西紅花酸(0.01、0.1、1μmol·L-1)與內皮細胞預孵12 h，可劑量依賴性降低AGEs刺激的p38 MAPK磷酸化增高作用，分別是AGEs組的87%、71%、66%。結果提示，西紅花酸可抑制p38 MAPK的磷酸化作用(Fig 3B)。

2.5西紅花酸對AGEs誘導內皮細胞后pp38MAPK活性的影響100 mg·L-1AGEs與內皮細胞共同培養(yǎng)30 min，磷酸化p38MAPK活性是對照組的約2.5倍。西紅花酸(0.1、1 μmol·L-1)與內皮細胞預孵12 h，可降低 AGEs刺激的 p-p38 MAPK活性，分別是對照組的1.4和1.9倍左右(P＜0.01或P＜0.05)，結果進一步證明，西紅花酸具有抑制p38 MAPK的磷酸化作用(Fig 4)。

3 討論

血管內皮細胞構成了組織與血液間的第一道屏障，它能直接感受血管內環(huán)境的改變，并做出相應的反應。內皮細胞功能紊亂是糖尿病血管病變的基礎和關鍵環(huán)節(jié)［1，12］。正常的血管內皮細胞，周邊清楚，細胞間連接緊密，F(xiàn)-actin是內皮細胞的主要骨架蛋白，分布在細胞周邊，呈完整的線條和有序排列，該形態(tài)是維持血管內壁正常通透性的基礎。本研究發(fā)現(xiàn):AGEs可使細胞骨架蛋白F-actin失去正常的網狀有序排列，并隨著 AGEs刺激時間延長，內皮細胞通透性升高。用西紅花酸預孵育后，內皮細胞損傷減輕，單層通透性減小，提示西紅花酸具有抑制內皮細胞通透性增高的作用，這是西紅花酸抗DM血管病變的可能機制之一。

Fig 3 Cell-based ELISA for activation of p-p38MAPK

Fig 4 Effect of crocetin on p-p38MAPK in endothelial cells induced by AGEs(n=4)

AGEs是體內蛋白質和糖的醛基在體內發(fā)生非酶促反應形成的不可逆的終末產物，它是DM患者加速發(fā)生血管病變的主要原因［12-13］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠在腸系膜血管中的AGEs沉積增多［4］，且顯示血管通透性增高。因此，在AGEs的慢性沉積和血管通透性升高之間可能存在某種聯(lián)系。有文獻報道AGEs刺激內皮細胞后，F(xiàn)-actin纖維形態(tài)和分布發(fā)生明顯的改變，內皮細胞收縮［3，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在AGEs作用下，在骨架蛋白重新分布排列的同時，伴隨內皮細胞分泌炎癥因子TNF-α和MCP-1增加，已知炎癥因子TNF-α等還可通過抑制eNOS酶活性降低NO生物利用度，使內皮細胞舒張功能受到損傷［15］。因此，我們推測:西紅花酸通過抑制TNF-α和MCP-1的分泌，抑制F-actin的破壞，干擾炎癥因子的分泌與內皮細胞通透性增高之間惡性循環(huán)的過程，從而產生保護血管的作用。

絲裂原激活蛋白激酶p38 MAPK是由Han等［16］用高滲和內毒素刺激哺乳動物細胞從中分離純化出的一種38 ku的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，其定位于細胞質與細胞核。p38 MAPK通路可能參與了內皮細胞通透性的調節(jié)，據報道，p38MAPK磷酸化激活可促進血管內皮通透性的增加，活化的p38 MAPK作用于底物MAPK激活的蛋白激酶MK2，后者則使熱休克蛋白-27(HSP-27)發(fā)生磷酸化作用。HSP-27是肌動蛋白結合蛋白，可抑制F-actin的聚合，磷酸化后的HSP-27失去了抑制作用，致使F-actin聚合形成應力纖維，內皮細胞收縮，血管通透性增加［17］。本研究發(fā)現(xiàn):AGEs刺激血管內皮細胞中p38 MAPK的磷酸化作用與AGEs的刺激時間具有明顯的依賴性，在AGEs刺激5 min后，細胞內磷酸化的p38 MAPK即有增加，在30 min時達到高峰，之后明顯下降。表明內皮細胞中p38 MAPK的激活是一個較短暫的過程，p38 MAPK所引起的較長期生物學效應可能有賴于其所激活的下游信號分子的作用，其中包括轉錄因子的作用。我們又用BMP為底物，測定了磷酸化p38 MAPK激酶的活性，結果表明，內皮細胞經AGEs刺激后，磷酸化p38 MAPK活性升高。因此可以認為AGEs可使p38 MAPK磷酸化作用增強。用西紅花酸預孵內皮細胞12 h后，磷酸化p38 MAPK表達下降，同時其活性也隨之下降，說明西紅花酸可以抑制p38 MAPK磷酸化，減輕由此所致的血管內皮細胞通透性增高，最終抑制了DM血管病變的產生和發(fā)展。

綜上所述，西紅花酸可能通過抑制p38 MAPK磷酸化作用，在減少炎癥因子分泌同時，抑制了AGEs誘導的細胞骨架蛋白的纖維形態(tài)和分布發(fā)生過程，從而抑制了AGEs促通透性增高的作用，這是西紅花酸抗DM血管病變的作用可能機制之一。但是，雖然西紅花酸具有較強的抗氧化作用，顯然它不是特異性p38 MAPK的抑制劑，但它又具有抑制p38 MAPK激活作用。我們推測:可能是由于西紅花酸清除了ROS，隨之解除了ROS激活p38 MAPK的作用，有關這方面的機制還需進一步研究。

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