白癜風(fēng)患者維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及免疫異常的研究

孫 越，韓 菁，吳瑞勤，謝匡成，朱光斗，施偉民

（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080）

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，嚴(yán)重影響患者身心健康。近年來研究表明白癜風(fēng)的發(fā)病與自身免疫有關(guān)，并有一定的遺傳背景[1]。維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）屬于包括雌激素、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺素和維甲酸類蛋白受體基因超家族成員，以往研究表明VDR基因多態(tài)性與多種疾病有非常密切的關(guān)系[2，3]。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)性檢測等方法研究了白癜風(fēng)患者VDR Apa I基因多態(tài)性及其與患者損害分布、T淋巴細(xì)胞亞群、免疫球蛋白和補(bǔ)體水平的相互關(guān)系，旨在探討VDR基因多態(tài)性對白癜風(fēng)免疫異常及發(fā)病的影響。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象 按照白癜風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，隨機(jī)選取我科門診白癜風(fēng)患者46例，男21例，女25例，均為生活在本地區(qū)的漢族人群，年齡4～65歲[平均（24.9±13.9）歲]。正常對照組來自同地區(qū)50例無血緣關(guān)系的健康人員，男27例，女23例，均為漢族，年齡 6～62 歲[平均（26.2±13.7）歲]。46 例白癜風(fēng)中尋常型 34例（73.91%），節(jié)段型 12例（26.09%）；進(jìn)展期26例（56.52%），穩(wěn)定期20例（43.47%）。46例中7例有家族史(15.22%)，所有患者近2個月內(nèi)未接受其他治療。

1.2 方法 VDR Apa I基因多態(tài)性檢測 ①抽取外周血1mL，2%EDTA抗凝，抽提基因組DNA。②參考文獻(xiàn)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)與合成[5]：上游引物：5’-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3’；下游引物：5’-TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3’。③PCR反應(yīng)及產(chǎn)物的純化、酶切：限制性內(nèi)切Apa I酶切后PCR產(chǎn)物顯示一條條帶，說明擴(kuò)增片段不含酶切位點(diǎn)(-/-)，用AA表示；顯示三條條帶，說明擴(kuò)增片段一條染色體上存在酶切位點(diǎn)而另一條染色體上無酶切位點(diǎn)，為雜合子(+/-)，用Aa表示；顯示兩條條帶，說明擴(kuò)增片段兩條染色體均有酶切位點(diǎn)(+/+)，用aa表示，見圖1。應(yīng)用BNⅡ型DADEBEHRING儀及相應(yīng)的試劑盒，采用免疫散射比濁法檢測IgG、IgA、IgM及C3、C4水平。淋巴細(xì)胞亞群采用EPICSXL型流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分別統(tǒng)計(jì)白癜風(fēng)組和正常對照組基因型和等位基因的分布頻率數(shù)據(jù)，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)后，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著。采用χ2檢驗(yàn)，比較白癜風(fēng)組和正常對照組VDR基因多態(tài)性的差異；VDR基因多態(tài)性與不同類型白癜風(fēng)的相關(guān)性。采用t檢驗(yàn)檢測各基因型與血清 IgA、IgM、IgG、C3、C4 以及CD3+、CD4+、CD8+之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 白癜風(fēng)組及正常對照組VDR Apa I基因型頻率分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，白癜風(fēng)組 (n=46)χ2=2.726，P>0.05；正常對照組(n=50)χ2=0.127，P>0.05，兩者均符合Hardy-Weinberg平衡群體。

2.2 白癜風(fēng)患者VDR Apa I基因多態(tài)性分析 見圖1，VDR基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到760bp片段。進(jìn)一步經(jīng)限制性內(nèi)切酶Apa I酶切，如果顯示一條帶，提示擴(kuò)增片段為純合子，兩條染色體皆存在G→T突變（GTGCCC），不含酶切位點(diǎn)，以AA表示；如果顯示三條條帶，說明擴(kuò)增片段為雜合子，即一條染色體上存在酶切位點(diǎn)（GGGCCC）而另一條染色體上為（GTGCCC），無酶切位點(diǎn)，以Aa表示；如果顯示兩條條帶，說明擴(kuò)增片段為純合子，即兩條染色體均有酶切位點(diǎn)（GGGCCC），以aa表示，由此可見VDR基因在Apa I酶切位點(diǎn)具有3種基因型。

白癜風(fēng)患者VDR基因的ApaI酶切位點(diǎn)的基因多態(tài)性與正常對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.638，P=0.036)。提示ApaI酶切位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與白癜風(fēng)發(fā)病存在一定的關(guān)系。見表1。

白癜風(fēng)患者與正常對照組VDR基因ApaI酶切位點(diǎn)的等位基因A/a分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.142，P=0.013)。白癜風(fēng)組a等位基因分布頻率高于正常對照組，提示等位基因a分布頻率的提高可能與白癜風(fēng)發(fā)病存在一定的關(guān)系。見表2。

圖1 VDR基因Apa I多態(tài)性PCR-RFLP結(jié)果

2.3 白癜風(fēng)不同分型、分期VDR基因Apa I酶切位點(diǎn)基因型特點(diǎn) 統(tǒng)計(jì)顯示：尋常型白癜風(fēng)34例中，AA基因型 2例 （5.88%），Aa基因型 7例（20.59%），aa基因型25例（73.53%）；節(jié)段型白癜風(fēng)12例中AA基因型1例（8.33%），Aa基因型3例（25%），aa基因型 8例（66.67%）。經(jīng) χ2分析，χ2=0.214，P=0.899。

進(jìn)展期白癜風(fēng)26例中，AA基因型2例（7.69%），Aa基因型5例（19.23%），aa基因型19例（73.08%）；穩(wěn)定期白癜風(fēng)20例中AA基因型1例（5%），Aa基因型 5例（25%），aa基因型 14例（70%）。經(jīng) χ2分析，χ2=0.315，P=0.854。提示白癜風(fēng)患者的不同分期及不同分型與VDR基因多態(tài)性的關(guān)系不明顯。

2.4 白癜風(fēng)VDR基因Apa I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與體液免疫水平的關(guān)系 見表3，白癜風(fēng)患者血清IgA水平顯著低于正常對照組（t=3.45，P＜0.01），補(bǔ)體水平顯著低于正常對照組（t=3.42，P＜0.01）；其中Aa、aa基因型組血清IgA水平顯著低于正常對照組（t=3.544，3.445，P＜0.05 與 P＜0.01）。提示白癜風(fēng) I gA的降低可能主要由Aa、aa基因型實(shí)現(xiàn)；進(jìn)一步檢測顯示aa基因型患者補(bǔ)體C3水平顯著低于正常對照組（t=3.417，P＜0.01），提示白癜風(fēng)色素缺失性的損傷可能存在補(bǔ)體的參與。

表1 白癜風(fēng)患者VDR基因的Apa I酶切位點(diǎn)多態(tài)性

表2 白癜風(fēng)患者VDR基因的Apa I酶切位點(diǎn)等位基因分布頻率的分析

2.5 白癜風(fēng)VDR基因Apa I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與細(xì)胞免疫水平的關(guān)系 見表4，白癜風(fēng)患者血清CD3+T淋巴細(xì)胞水平顯著低于正常對照組（t=2.99，P＜0.01）；其中aa基因型組CD3+T淋巴細(xì)胞水平顯著低于正常對照組（t=2.37，P＜0.05）。提示CD3+T淋巴細(xì)胞水平的降低，尤其是aa基因型CD3+T淋巴細(xì)胞水平的降低可能與白癜風(fēng)發(fā)表存在一定關(guān)系。

表3 白癜風(fēng)VDR基因Apa I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與體液免疫水平的關(guān)系（±s）

表3 白癜風(fēng)VDR基因Apa I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與體液免疫水平的關(guān)系（±s）

注：與正常對照組比較 **P<0.05，*P<0.01。

IgA 2.58±0.62 1.65±0.73**1.65±0.73*1.71±0.74*2.00±0.82 IgG 13.13±1.63 12.4±2.03 13.21±2.33 13.03±2.22 11.66±1.66 IgM 1.05±0.22 1.29±0.18 1.36±0.47 1.33±0.42 1.33±0.46 VDR基因型AA（3）Aa（10）aa（33）總和（46）正常對照組（50）C3 1.22±0.02 1.13±0.11 1.13±0.19*1.13±0.17*1.29±0.27 C4 0.23±0.04 0.24±0.09 0.21±0.07 0.22±0.07 0.21±0.06

表4 白癜風(fēng)VDR基因Apa I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與細(xì)胞免疫水平的關(guān)系（±s）

表4 白癜風(fēng)VDR基因Apa I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與細(xì)胞免疫水平的關(guān)系（±s）

注：與正常對照組比較 **P<0.05，*P<0.01。

CD3+69.83±2.66 63.55±8.58 67.47±7.50**66.77±7.64*70.16±2.33 CD4+37.8±5.43 38.83±4.89 34.29±3.34 35.51±4.23 37.81±1.65 CD8+31.33±3.84 30.25±4.64 27.12±4.63 27.48±4.73 26.30±4.38 VDR基因型AA（3）Aa（10）aa（33）總和正常對照組（50）CD4/CD8 1.21±0.14 1.31±0.33 1.30±0.25 1.32±0.2 1.33±0.20

3 討論

維生素 D 受體（VDR） 是介導(dǎo) 1，25-（OH）2-VitD3，發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，人類維生素D受體（VDR）基因位于常染色體12q12-14,是親核蛋白，由427個氨基酸殘基組成，系雌激素、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺素和維甲酸類蛋白受體基因超家族成員，它們可直接調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程。以往研究表明VDR基因多態(tài)性與多種疾病有非常密切的關(guān)系[6]。研究表明，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞與黑素細(xì)胞均表達(dá)VDR，1，25（OH）2D3是通過VDR結(jié)合作用于靶組織而發(fā)揮生物效應(yīng)，因而推測VDR基因的變異可能影響維生素D3生物效應(yīng)的發(fā)揮，VDR基因型的不同可能對維生素D3生物效應(yīng)有一定影響[7，8]。1，25（OH）2D3參加黑素合成的調(diào)節(jié)，它可致酪氨酸酶活性增加。近幾年來國內(nèi)外報(bào)道應(yīng)用1.25（OH2）D維生素D3類軟膏（卡泊三醇）外用并聯(lián)合口服補(bǔ)骨脂素加UVA治療白癜風(fēng)效果顯著[9]。由于黑素細(xì)胞能表達(dá)1.25（OH2）D3受體，該受體與調(diào)節(jié)黑素合成有關(guān)；而白癜風(fēng)皮損區(qū)整個表皮單位鈣的內(nèi)在穩(wěn)定性受損，即角質(zhì)形成細(xì)胞攝鈣與黑素細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。細(xì)胞內(nèi)鈣減少導(dǎo)致硫氧還原蛋白濃度增加，從而抑制了酪氨酸酶活性。故卡泊三醇可能通過黑素細(xì)胞上的維生素D3受體或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂而發(fā)揮作用，促使黑素細(xì)胞體積增大，樹枝狀突增多，分泌黑素顆粒。體外實(shí)驗(yàn)亦顯示維生素D3可加強(qiáng)酪氨酸酶活性和黑素產(chǎn)量[10]。雖然外用卡泊三醇并聯(lián)合口服補(bǔ)骨脂素加UVA治療白癜風(fēng)效果較好，但仍有一些病人效果不佳[11]，因此推測VDR基因型的不同可能對治療效果有一定影響。研究表明白癜風(fēng)進(jìn)展期患者VDR表達(dá)水平降低[7]，VDR基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病和腫瘤有密切關(guān)系，國外曾報(bào)導(dǎo)了VDR基因型的不同與糖尿病、絕經(jīng)婦女患骨質(zhì)疏松癥危險(xiǎn)性以及銀屑病發(fā)生的早晚嚴(yán)重程度有關(guān)[12]。我們的研究結(jié)果表明白癜風(fēng)患者和正常對照組的VDR Apa I位點(diǎn)基因型分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，aa基因型在白癜風(fēng)患者中出現(xiàn)的頻率要高于正常對照組；而白癜風(fēng)節(jié)段型與尋常型患者、進(jìn)展期與穩(wěn)定期患者VDR Apa I位點(diǎn)基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與楊勵等研究報(bào)道結(jié)果相符[13]。白癜風(fēng)在體液免疫中主要涉及黑素細(xì)胞相關(guān)的自身抗體。細(xì)胞免疫則是有體內(nèi)T淋巴細(xì)胞發(fā)揮特異性免疫效應(yīng)所致的黑素細(xì)胞破壞或損傷[14]。IgA是一類具有α鏈的免疫球蛋白。IgA水平降低可見于自身免疫性疾病,腎病綜合征,慢性淋巴細(xì)胞白血病等。我們結(jié)果顯示Aa、aa基因型白癜風(fēng)患者外周血免疫球蛋白IgA水平明顯低于正常對照組（P<0.05，P<0.01)，補(bǔ)體 C3 活性明顯低于健康組（P<0.01），說明白癜風(fēng)患者存在體液免疫學(xué)的異常。

關(guān)于白癜風(fēng)患者外周血T淋巴細(xì)胞的確切變化，目前報(bào)道的結(jié)果多不一致。研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)的細(xì)胞免疫學(xué)異常主要表現(xiàn)在外周血CD4+T細(xì)胞減少，而局部浸潤卻以CD8+T細(xì)胞為主。本研究顯示aa基因型白癜風(fēng)患者外周血CD3+T細(xì)胞百分比明顯低于正常對照組（P<0.01）與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[15]。說明白癜風(fēng)患者T細(xì)胞亞群失衡和細(xì)胞免疫功能異常，支持細(xì)胞免疫機(jī)制參與白癜風(fēng)的發(fā)病過程這一學(xué)說。據(jù)此，我們推測存在VDR基因aa基因型的白癜風(fēng)患者可能通過影響免疫功能，進(jìn)而增加白癜風(fēng)的易感性。

VDR基因多態(tài)性與白癜風(fēng)有一定的關(guān)系，其中aa基因型個體患白癜風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)較高，且白癜風(fēng)高?；蛐涂赡苡绊憘€體的免疫功能進(jìn)而致病。這對闡明白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理，了解其基因背景及其與免疫學(xué)異常的相互關(guān)系有非常重要的價值，對開發(fā)和評估維生素D類白癜風(fēng)治療制劑具有重要的指導(dǎo)意義。

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