殼聚糖絮凝沉降法與乙醇沉淀法對(duì)炙甘草湯的純化效果的比較

孫運(yùn)從， 林桂濤， 盛華剛， 王 鵬

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355)

殼聚糖絮凝沉降法是近幾年研究較多的用于中藥提取液純化的方法。相對(duì)于常用的乙醇沉淀法有操作簡單，節(jié)省乙醇，成本低的優(yōu)點(diǎn)。但此方法在對(duì)中醫(yī)古代經(jīng)典名方制劑純化方面研究的較少，為此以炙甘草湯為樣本，考察殼聚糖絮凝沉降法的純化效果，以加強(qiáng)對(duì)中醫(yī)古代經(jīng)典名方開發(fā)的研究。炙甘草湯出自于《傷寒論》，方由炙甘草、生姜、桂枝、人參、生地、阿膠、麥冬、麻仁、大棗組成，用于太陽病心陰陽兩虛證的治療。研究時(shí)以處方中活性成分或指標(biāo)成分為指標(biāo)，確定殼聚糖絮凝沉降的最佳工藝，比較沉降前后成分損失情況，并與乙醇沉淀法進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC－10A高效液相色譜儀，色譜柱:Kromasil C18(5 μm、4.6 mm × 200 mm)，十萬分之一電子天平(梅特勒公司提供)，離心機(jī)(LD5－10，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 材料 所用試劑均為分析純或色譜純;殼聚糖(山東奧康生物科技有限公司提供);無水葡萄糖對(duì)照品，人參皂苷Rb1(110704－200318)，甘草酸單銨鹽(110731－200614)均購于中國藥品生物制品檢定所。藥材均購自濟(jì)南建聯(lián)中藥材店，經(jīng)檢驗(yàn)均符合2005年版《中國藥典》一部相應(yīng)品種項(xiàng)下的質(zhì)量要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 殼聚糖純化工藝參數(shù)的考察 殼聚糖絮凝沉降法純化的過程中，提取液濃縮程度、沉降時(shí)靜置溫度、殼聚糖的加入量、沉降液pH值等因素會(huì)對(duì)純化效果產(chǎn)生影響［1－3］。為此，以提取液中甘草酸、總多糖、總皂苷的量和浸膏率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)的方法，考察各因素對(duì)純化效果的影響，以優(yōu)選出較佳的純化工藝?？疾斓囊蛩厮揭姳?。

表1 因素水平

炙甘草湯提取液的制備:稱取炙甘草湯中炙甘草等其余八味藥材(阿膠除外)，加22倍量水，煎煮3 h，濾過，濾液濃縮至每1mL相當(dāng)于生藥1 g的藥液。

精密量取濃度為1 g生藥/mL的藥液25 mL、0.50 g生藥/mL的藥液50 mL、0.25 g生藥/mL的藥液100 mL，加熱至70℃，按正交表中的設(shè)計(jì)，加1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，加相應(yīng)百分比體積的殼聚糖溶液(殼聚糖加1%醋酸溶液使溶解，制成濃度為1%的溶液)，攪拌20 min，置于相應(yīng)的溫度環(huán)境內(nèi)靜置12 h，離心(3 000 r/min)15 min，上清液轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.1 藥液中甘草酸的測定［4］色譜條件:以十八烷基鍵合硅膠為填充劑;以甲醇－0.2 mol/mL醋酸銨溶液－冰醋酸(67:33:1)為流動(dòng)相;檢測波長為250 nm。

藥液中甘草酸的測定:精密量取純化后的藥液15 mL(相當(dāng)于生藥的1.5 g)，蒸干，加流動(dòng)相20 mL使溶解，定量轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，超聲處理30 min，放冷，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液供測定甘草酸。結(jié)果見表2。

2.1.2 藥液中總皂苷的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，分別精密量取 10、20、40、60、100 μL 置 5 mL 量瓶中，熱風(fēng)揮去溶劑，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于60℃水浴加熱15 min，取出，立即用冷水冷卻，加冰醋酸至刻度，搖勻，放置30 min后于550 nm處測定吸收度。結(jié)果人參皂苷Rb1對(duì)照品在4～40 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為:

藥液中總皂苷的測定:精密量取純化后的藥液10 mL(相當(dāng)于1 g生藥)，用乙醚提取至乙醚層無色，棄去乙醚液，水層用水飽和正丁醇提取6次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，通過D－101大孔樹脂柱(ф1.5 cm×10 cm)，先用水100 mL洗脫，再用20%乙醇100 mL洗脫，棄去水和20%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作測定，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

2.1.3 藥液中多糖的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:稱取已干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品，加水制成每1mL含0.35 mg的溶液，精密吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于 10 mL具塞刻度試管中，各加水至2.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置沸水浴中加熱10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑按同樣處理方法為空白，在585 nm波長處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，取樣量X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果葡萄糖對(duì)照品在35～210 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=0.004 5X+0.027，r=0.999 7。

藥液中多糖的測定:精密量取純化后的藥液10 mL(相當(dāng)于1 g生藥)，加乙醇調(diào)至乙醇濃度為80%，靜置12 h，離心(3 500 r/min)30 min，傾去上清液，殘?jiān)?0%乙醇25 mL，超聲處理10 min，離心，傾去上清液，沉淀加水使溶解，定量轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密吸取0.5 mL置10 mL具塞刻度試管中，同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

2.1.4 藥液中浸膏的測定 精密吸取純化后的藥液20 mL(相當(dāng)于原藥材2 g)，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿，蒸干，于105℃烘3 h，取出，置于玻璃干燥器中冷卻30 min后稱重，計(jì)算浸膏率，結(jié)果見表2。

表2 殼聚糖純化條件L9(34)正交考察

2.1.5 結(jié)果 由直觀分析和方差分析可以看出:①以甘草酸為指標(biāo)，對(duì)絮凝沉降效果影響最大的因素是藥液的pH值(P＜0.05)，其次為殼聚糖的加入量，藥液的濃度影響較小，但與靜置溫度等三者均無明顯的影響。最佳條件為A1B1C1D3。②以總皂苷為指標(biāo)，對(duì)結(jié)果影響最大的因素為藥液的濃度(P＜0.05)，而藥液的pH值影響最小，但與靜置溫度、殼聚糖的加入量均無明顯影響。最佳條件為A1B3C2D2。③以總多糖為指標(biāo)，藥液的濃度和殼聚糖的加入量對(duì)結(jié)果影響較大(P＜0.05)，藥液的pH值和靜置溫度對(duì)結(jié)果影響較小。最佳條件為A1B1C1D3。④各因素對(duì)浸膏率的減小的作用接近，最佳條件為A1B1C3D1。⑤綜合以上結(jié)果，藥液的pH值對(duì)甘草酸的影響較大，而對(duì)其他指標(biāo)成分影響較小。在pH值較高時(shí)，甘草酸的損失量較小。藥液濃度對(duì)總皂苷和多糖的損失影響較大，濃度高時(shí)損失較小，藥液濃度對(duì)其他指標(biāo)影響較小;殼聚糖的加入量對(duì)多糖影響較大而對(duì)其他指標(biāo)影響較小。隨著殼聚糖加入量的增加，多糖損失增大。放置的溫度對(duì)指標(biāo)均無明顯的影響，因此可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的情況進(jìn)行選擇。

綜合以上分析，確定最佳純化工藝條件為A1B1C1D3。即將藥液濃縮至濃度為1.0 g生藥/mL，加熱至70℃，調(diào)藥液pH值為6，加入10%的1%殼聚糖醋酸溶液，混勻，靜置12 h，濾過，即得。

2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照確定的工藝進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.2 與乙醇沉淀工藝的比較

2.2.1 乙醇沉淀處理 精密量取原藥液30 mL，加乙醇使含醇量達(dá)到70%，低溫(5℃)冷藏靜置12 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，作為乙醇沉淀法供試品溶液。

同時(shí)測定未純化處理的藥液中各指標(biāo)成分的量，并對(duì)殼聚糖絮凝沉降藥液和乙醇沉淀藥液進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，殼聚糖純化法和乙醇沉淀法均能造成

成分的損失，但是兩種方法對(duì)不同成分的保留量有差異，乙醇沉淀法對(duì)甘草酸造成的損失較殼聚糖沉淀法小，而殼聚糖絮凝沉降法對(duì)總皂苷和多糖的保留效果比乙醇沉淀法好，以保留成分的總量來看，殼聚糖沉淀法較乙醇沉淀法好。

3 討論

3.1 由于本方藥材中含有較多的多糖、皂苷類成分［5－8］，因此在本實(shí)驗(yàn)中選擇甘草酸的含量、總多糖、總皂苷和浸膏率為考察指標(biāo)，優(yōu)選殼聚糖的最佳澄清工藝。

3.2 兩種方法均能造成成分的損失，不同的方法對(duì)相同成分的影響不同.在本處方中，對(duì)君藥炙甘草的活性成分甘草酸的保留效果，乙醇沉淀法較殼聚糖沉淀法好，而殼聚糖絮凝沉降法對(duì)總皂苷和多糖的保留效果比乙醇沉淀法好，以保留成分的總量來看，殼聚糖沉淀法較乙醇沉淀法好。一般情況下，純化工藝均會(huì)對(duì)有效成分的轉(zhuǎn)移率產(chǎn)生影響，好的純化工藝應(yīng)是相對(duì)較多保留有效成分。因此殼聚糖澄清劑可以用于炙甘草湯提取液的純化。

3.3 中藥復(fù)方制劑的藥效不僅與有效成分或指標(biāo)成分的含量有關(guān)，也與成分之間的組成比例有密切的關(guān)系，成分比例的不同能夠造成制劑作用性質(zhì)的較大的差異。本實(shí)驗(yàn)表明，原藥液(未經(jīng)乙醇沉淀或殼聚糖沉淀的藥液)中三類成分之間的比例為:甘草酸－總皂苷－總多糖=61∶82∶1，乙醇沉淀法為:292∶113∶1，殼聚糖沉淀法為:52∶53∶1。由此可見，無論是乙醇沉淀法還是殼聚糖沉淀法均造成原藥液中成分之間比例的改變，因而，亦可能造成藥效性質(zhì)的改變。

［1］王海寧，謝印芝，樊飛躍.殼聚糖及ZTC1+1－Ⅱ澄清劑對(duì)大青葉提取液的澄清工藝研究［J］.中國藥房，2008，19(21):1625－1628.

［2］劉 益，王玉蓉，許文博.殼聚糖絮凝沉淀法在牛膝純化工藝中的應(yīng)用性研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(7):825－828.

［3］彭智聰，張少文，劉德焱等.殼聚糖用于清熱解毒口服液澄清工藝的探討［J］.中成藥，2000，22(4):299－300.

［4］中國藥典［S］.一部.2005:59.

［5］倪慕云，邊寶林.地黃化學(xué)成分的研究概況［J］.中國中藥雜志，1989，14(7):4l－43.

［6］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草［M］.北京:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1996:1143.

［7］易進(jìn)海.麥冬研究進(jìn)展［J］.華西藥學(xué)雜志，1993，8(1):32－38.

［8］芮春蘭.國內(nèi)對(duì)甘草化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.中國校醫(yī)，2006，20(1):105－106.