HPLC法測定癌痛巴布劑中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿

李智勇， 鄧亞利， 孫冬梅

(1.廣東省中醫(yī)研究所廣東廣州 510095;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系，廣東 廣州 510642)

癌痛巴布劑是在中醫(yī)藥"內(nèi)病外治"理論的指導(dǎo)下，將傳統(tǒng)中醫(yī)藥和現(xiàn)代經(jīng)皮給藥理論相結(jié)合而研發(fā)的一種治療癌痛的中藥復(fù)方經(jīng)皮給藥制劑。癌痛巴布劑由草烏、生天南星、赤芍、乳香、生姜等藥物組成，原為廣東省第二中醫(yī)院臨床實(shí)踐應(yīng)用于治療各種惡性腫瘤所致疼痛的經(jīng)驗(yàn)處方，具有溫經(jīng)通絡(luò)、消瘤止痛的功效，主要用于寒凝經(jīng)脈、瘀血阻滯引起的癌癥疼痛。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測定癌痛巴布劑中君藥草烏的主要有效成分烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，為癌痛巴布劑的質(zhì)量控制和保障臨床用藥安全提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國);VWD檢測器;電子天平BP-211D(Sartorius，德國)。癌痛巴布劑(批號:090916、090917、090918)(自制)。烏頭堿對照品(aconetine)(110720-200410)、次烏頭堿對照品(hyaconitine)(798-9403)、新烏頭堿對照品(mesaconitine)(799-9403)，均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Elipse CDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相 乙腈-0.2% 冰乙酸(加三乙胺調(diào)節(jié)pH值為6.25)(29∶71);體積流量1.0 mL/min;檢測波長235 nm;柱溫30℃。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品適量，加0.01 mol/L鹽酸甲醇溶液制成每1 mL含烏頭堿26.8 μg、次 烏 頭 堿 72.6 μg、新 烏 頭 堿 對 照 品163.2μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品3片，除去蓋襯，剪碎，混勻，精密稱取約0.5片癌痛巴布劑，置具塞錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，藥渣再加入無水乙醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，合并，濾液揮干，殘?jiān)?0 mL 0.6 mol/L的鹽酸轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入乙醚萃取3次(20 mL，10 mL，10 mL)，取酸水層，加氨試液調(diào)pH值至9，加乙醚萃取3次(10 mL，10 mL，10 mL)，合并乙醚溶液，蒸干，加0.01 mol/L的鹽酸甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)入25 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 按癌痛巴布劑的制備工藝制備缺草烏的陰性對照制劑，并按供試品溶液制備方法制成草烏陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)色譜方法測試，結(jié)果供試品中其他雜質(zhì)峰亦不干擾各待測成分的測定，且分離理想，空白無干擾。見圖1～3。

圖1 新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of aconitine，mesaconitine and hypaconitine

圖2 癌痛巴布劑HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Aitong Cataplasm

圖3 陰性樣品HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of negative sample

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿混合對照品溶液 2、4、6、8、10、12μL進(jìn)行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線:烏頭堿:Y=1.173 9X+1.833 1，r=1;次烏頭堿:Y=1.265 1X+1.521，r=1;新烏頭堿:Y=1.272 4X+5.026 9，r=1，表明烏頭堿在 53.6 ～321.6 ng 進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，次烏頭堿在145.2～871.2 ng進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，新烏頭堿在326.4～1 598.4ng進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿混合對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得峰面積積分值 RSD分別為0.43%，0.11%，0.10%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取癌痛巴布劑(批號:090916)，按樣品制備方法制成供試品液，分別在0、2、4、6、8h不同時(shí)間間隔進(jìn)樣 10μL 測定，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積積分值，RSD分別為0.76%，0.62%，0.46%，表明烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿在8 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的測定方法，對同一批樣品(批號:090916)分別制備供試液，共平行制備5份，測得峰面積并計(jì)算供試品中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿量，結(jié)果 RSD分別為 1.93%，1.81%，1.44%，表明重復(fù)性良好。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取已測定的樣品(批號090916，每片平均含烏頭堿0.83 mg，次烏頭堿0.87 mg，新烏頭堿 7.54 mg，每片平均質(zhì)量為 11.583 6 g)，分別精密加入一定量的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品，按供試品制備與測定方法，以2.1項(xiàng)色譜條件測定，平行做6組，結(jié)果見表1。

表1 烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿加樣回收率測定結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery test of aconitine，mesaconitine and hypaconitine(n=6)

2.4.7 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。結(jié)果見表2。

表2 癌痛巴布劑中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination of aconitine，mesaconitine and hypaconitine in Aitong Cataplasm(n=3)

3 討論

3.1 測定指標(biāo)的選擇 癌痛巴布劑為臨床實(shí)踐應(yīng)用于治療各種惡性腫瘤所致疼痛的經(jīng)驗(yàn)方劑，草烏為君藥之一，其中所含烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、N-脫酸刺烏頭堿、滇烏頭堿等雙酯型二萜生物堿是其鎮(zhèn)痛麻醉的主要活性成分，以烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的量最高［1-4］。由于酸性染料比色法供試品溶液處理繁雜，并且最終需要進(jìn)行脫水處理，否則將會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響［5-7］。因此本試驗(yàn)通過建立癌痛巴布劑中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的HPLC測定方法，為癌痛巴布劑的質(zhì)量控制和臨床用藥提供了依據(jù)。

3.2 提取方法的選擇 烏頭堿類成分在堿性條件下不穩(wěn)定，尤其不適宜采用堿性溶劑例如甲醇、氨水浸泡等進(jìn)行處理，本試驗(yàn)曾采用純水、含水甲醇和不同濃度的乙醇作為溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，加熱后易使供試品膏體溶化，不易濾過，結(jié)果顯示，宜采用無水乙醇超聲處理提取，采用酸提堿沉法進(jìn)行純化處理制備供試品;經(jīng)過方法學(xué)考察顯示，加無水乙醇超聲處理2次，每次30 min，烏頭堿總堿的量即不再增加。在酸水溶解除雜過程中，曾采用加氨試液調(diào)pH值至8后以乙醚萃取，但由于烏頭總堿多處于離子狀態(tài)而不易被萃取出來，又由于烏頭堿在過強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定，故將pH調(diào)至9，效果較好。

3.3 流動相的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道［8-11］烏頭堿定量測定多以甲醇和乙酸銨、三乙胺等調(diào)節(jié)pH值后為流動相，一般不易使烏頭堿、次烏頭堿、和新烏頭堿分離，或是色譜峰易產(chǎn)生拖尾、塌峰等現(xiàn)象，本研究采用乙腈 －0.2%冰乙酸(加三乙胺調(diào)節(jié) pH值為6.25)為流動相，經(jīng)過調(diào)節(jié)不同的比例，結(jié)果在比例為29∶71時(shí)即可使三者完全分離，峰形良好，并且陰性無干擾。

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