玄參腦保護(hù)作用提取物的工藝優(yōu)化

李 娟， 蕭 偉， 劉 濤， 王永香， 王 偉

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210046;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001;3.成都大學(xué)，四川成都 610106)

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒，味苦、甘、咸，具有清熱涼血，瀉火解毒，滋陰等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明玄參具有抗炎、降壓、抗乙肝病毒［1］、增強(qiáng)免疫［2］等作用，尤其是在心腦血管方面具有抗動(dòng)脈粥樣硬化［4］、抑制血小板聚集［5］、以及保護(hù)局灶性腦缺血等［6］的作用。其中以哈巴俄苷和哈巴苷為代表的環(huán)烯醚萜類成分是玄參滋陰的主要藥效成分［3］。故本實(shí)驗(yàn)以干浸膏得率、哈巴苷、哈巴俄苷的轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，優(yōu)化玄參的水提醇沉工藝參數(shù)，并通過藥理學(xué)指標(biāo)考察了純化前后對藥效學(xué)的影響，從而進(jìn)一步說明工藝的合理性。

1 儀器和試藥

Waters 2695高效液相色譜儀(包括2695四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，Waters 2996二極管陣列檢測器Empower色譜工作站);BP211D電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(申順生物科技有限公司);SHZ-ⅢD型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器)。

玄參購自湖北藥材有限公司(經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量部鑒定，為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根);哈巴苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111729-200602)，哈巴俄苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111730-200604);甲醇、乙腈為色譜純，水為雙重蒸餾水;其他試劑均為分析純。尼莫地平，山東新華制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號 0909215;2，3，5-氯化三苯基四氮唑，sigma公司生產(chǎn);超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量280～300 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號SCXK(浙)2008-0033。

2 方法與結(jié)果

2.1 哈巴苷，哈巴俄苷的測定

2.1.1 色譜條件 Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)－0.03%磷酸水溶液(B);依據(jù)2010版中國藥典玄參項(xiàng)下的測定方法進(jìn)行洗脫，體積流量:1 mL/min;檢測波長前13 min為210 nm和13 min后為280 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定5.28 mg的哈巴苷和1.91 mg的哈巴俄苷置20 mL的量瓶中，用30%甲醇定容，搖勻，再從中精密吸取1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品，置10 mL的量瓶中，加30%甲醇定容，即得每1 mL含有哈巴苷52.8 μg和哈巴俄苷19.1 μg的對照品溶液備用。

2.1.3 哈巴苷，哈巴俄苷的線性關(guān)系考察 分別精密吸取264 μg/mL 哈巴苷和95.1 μg/mL 的哈巴俄苷混合溶液0.4、1.0、2.0、5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加 30% 甲醇定容，搖勻。按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 μL，測得峰面積，以對照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算哈巴苷的線性回歸方程為:Y=3 068.7X－1 835，r=0.999 7。哈巴俄苷的線性回歸方程:Y=25 253X－7 099.1，r=0.999 7。結(jié)果表明，哈巴苷在10.56 ～264 μg/mL，哈巴俄苷在3.82 ～95.5 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 干浸膏的測定 干浸膏得率的計(jì)算:精密量取供試品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿上，水浴揮干溶劑，105℃干燥至恒重，移至干燥器中，冷卻30 min，立即精密稱重，計(jì)算干浸膏的得率。

2.3 醇沉正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 根據(jù)初步試驗(yàn)工藝設(shè)計(jì)，得到最佳水提工藝為浸泡1 h，8倍量的熱水，提取3次，每次1.5 h。按照上述最佳結(jié)果，進(jìn)行醇沉的最佳工藝考察。

2.3.1 醇沉因素與水平的確定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，醇沉?xí)r相對密度在1.10以下，醇沉效果不理想;當(dāng)大于1.20時(shí)，藥液太濃，乙醇不易分散，因此藥液相對密度水平設(shè)定為1.10、1.15、1.20。并按照表1和表2的試驗(yàn)安排對醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果見表3。

表1 醇沉的因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

根據(jù)極差和方差分析結(jié)果可知，影響醇沉工藝因素的順序是B＞D＞A，B、D對醇沉工藝有極顯著的影響，采用兩兩比較LSD檢驗(yàn)，可知，密度為1.15和1.10相差不大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而1.15可節(jié)約乙醇用量，更適合工業(yè)化大生產(chǎn)的要求，故最佳相對密度為 1.15，故優(yōu)選的最佳工藝為A2B1D3。即相對密度為1.15，調(diào)整含醇量為60%，靜置36 h。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述篩選的結(jié)果重新進(jìn)行3次試驗(yàn)，驗(yàn)證工藝的穩(wěn)定性，得到其干膏率、哈巴苷、哈巴俄苷平均轉(zhuǎn)移率依次為20.05%、98.63%，96.36%，綜合評分的均值85.87%，RSD值為1.62%。表明優(yōu)選的醇沉工藝穩(wěn)定、合理、可行。

基于中藥發(fā)揮作用的多成分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，單純從化學(xué)指標(biāo)來篩選工藝尚不足以說明工藝的合理性。為此，本實(shí)驗(yàn)又以對腦缺血再灌注保護(hù)作用為指標(biāo)對醇沉前后的玄參溶液進(jìn)行了藥效學(xué)考察，以便進(jìn)一步佐證工藝的合理性。

2.4 醇沉前后對腦缺血再灌注保護(hù)作用的影響 選取體質(zhì)量在280～300 g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型組(前兩組均給予生理鹽水灌胃)、尼莫地平組(10.8 mg/kg)、玄參水提液組(30 g/kg，相對于生藥的量)和玄參水提醇沉液組(30 g/kg)。根據(jù)Zea Longa等［7］方法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion MCAO)模型，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分離、結(jié)扎并切斷右側(cè)頸外動(dòng)脈，由頸外動(dòng)脈殘端沿頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入頭端膨大的尼龍魚線約18 mm，阻塞大腦中動(dòng)脈入口造成缺血。缺血3 h后拔出栓線進(jìn)行24 h再灌注，假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈但不插線。于缺血/再灌24 h后斷頭取腦，測其濕重及于105℃干燥48 h至恒重后的干重，并按下式計(jì)算腦組織的含水量;于再灌24 h后斷頭取腦，行2 mm厚的冠狀切片5片，置于2% 紅四氮唑(TTC)溶液中37℃孵育30 min，正常腦組織呈現(xiàn)深紅色，梗死灶呈白色，利用圖像處理軟件(AutoCAD)得5個(gè)腦片缺血側(cè)的總面積和梗死區(qū)域的面積，并計(jì)算梗死區(qū)域占大腦半球總面積的百分比。結(jié)果見表4。

結(jié)果顯示，模型組與假手術(shù)組相比差異顯著(P＜0.01)，大鼠腦水腫明顯;玄參水提液、玄參水提醇沉后與玄參水提均可降低MCAO大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，改善大鼠缺血/再灌注后的行為障礙，明顯減少梗死百分比，減輕腦水腫程度;含等生藥量的玄參提取液及玄參醇沉液對腦缺血再灌注模型的保護(hù)無顯著性差異，說明醇沉后藥效成分未減少，同時(shí)干膏率又有較大的降低，故醇沉適合玄參水提液的純化。

表4 玄參提取物對大鼠神經(jīng)功能學(xué)，腦組織含水量和梗死面積的作用 (±s，n=8)

表4 玄參提取物對大鼠神經(jīng)功能學(xué)，腦組織含水量和梗死面積的作用 (±s，n=8)

組別 神經(jīng)功能評分 腦組織含水量/% 腦梗死面積測定/%假手術(shù)76.9 ±0.034 0模型 7.50 ±1.58 83.5 ±0.054* 25.89 ±5.96尼莫地平 4.78±2.11▲▲ 78.7±0.021▲ 15.75±5.08▲▲玄參水提液 4.80±1.93▲▲ 76.1±0.059▲ 17.83±8.44▲玄參水提醇沉液 5.40±1.90▲ 78.1±0.028▲ 17.94±5.70 0▲

3 討論

在工藝優(yōu)化的初步階段，以浸泡時(shí)間、溶媒用量、煎煮次數(shù)和煎煮時(shí)間為考察因素，以哈巴俄苷、哈巴苷的轉(zhuǎn)移率及干浸膏的量為指標(biāo)，采用L9(34)表優(yōu)選水提工藝，為了驗(yàn)證工藝的準(zhǔn)確性，進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到干膏得率、哈巴苷和哈巴俄苷平均轉(zhuǎn)移率依次為51.90%，71.06%，71.57%。

藥材中苷類成分常與酶共存，在適宜的溫度和濕度下，易使苷類水解，因此，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了酶對哈巴苷和哈巴俄苷的影響，即采用冷水浸泡時(shí)，哈巴苷，哈巴俄苷的轉(zhuǎn)移率分別為33.08%、30.09%，而采用沸水浸泡后，兩者的轉(zhuǎn)移率分別為65.47%、60.64%，故選用熱浸法來提取。

目前，國內(nèi)外對哈巴俄苷的研究報(bào)道比較多［3，8-9］，但對哈巴苷的檢測及其活性的研究比較少?，F(xiàn)代藥理研究表明玄參中水溶性成分是其主要藥效成分［10］，而哈巴苷、哈巴俄苷都是其水溶性成分，且兩者在藥材中量也相對較高。因此，選擇哈巴苷、哈巴俄苷做為工藝篩選的指標(biāo)可最終確保玄參提取物的藥效。

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