指紋圖譜法優(yōu)選訶子提取工藝的研究

劉雅敏， 郭丹丹， 楊 晉， 張正偉， 劉延澤

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450008；2.北方民族大學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川750021；3.洛陽市中心醫(yī)院，河南洛陽 471000）

指紋圖譜法優(yōu)選訶子提取工藝的研究

劉雅敏1， 郭丹丹1， 楊 晉2， 張正偉3， 劉延澤1

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450008；2.北方民族大學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川750021；3.洛陽市中心醫(yī)院，河南洛陽 471000）

目的 優(yōu)選訶子有效部位的提取工藝參數(shù)。方法 運(yùn)用正交L8（27）實(shí)驗(yàn)，以各提取實(shí)驗(yàn)條件的HPLC指紋圖譜色譜峰面積的變化量和相似度為指標(biāo)，考察提取工藝條件。結(jié)果 優(yōu)化的訶子提取工藝參數(shù)為藥材粒度60目、70%乙醇、8倍溶劑量、浸漬提取3次，每次30 min。結(jié)論 指紋圖譜技術(shù)可以作為工藝篩選過程中的有效評(píng)價(jià)手段。

訶子；提取工藝；指紋圖譜

訶子為使君子科欖仁屬植物訶子Terminalia chebulaRetz.及其變種絨毛訶子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽、調(diào)和藥性、解毒等功效［1］?，F(xiàn)代研究顯示，訶子具有抗氧化、抗菌、抗病毒、強(qiáng)心、抗誘變、抗癌、抗阿米巴原蟲、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及強(qiáng)心作用等藥理作用［2-3］，這些作用主要集中于可水解丹寧類成分［4］。目前在訶子提取工藝研究中，多采用總丹寧成分量作為工藝優(yōu)選指標(biāo)。但這類成分化學(xué)穩(wěn)定性差，總丹寧量變化不能全面反映出工藝因素對(duì)藥材中丹寧類成分的提取率以及穩(wěn)定性的影響，因而無法得出真正的最佳提取工藝條件，也使制劑質(zhì)量難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化控制。目前指紋圖譜被認(rèn)為是能夠較全面地反映藥材提取物質(zhì)量變化的質(zhì)控技術(shù)。故本實(shí)驗(yàn)以選定指紋圖譜色譜峰面積的變化量和相似度為指標(biāo)，以訶子中的主要有效成分和特征性成分訶子酸（chebulinic acid）［5］為參照物，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選提取工藝參數(shù)，為保證訶子提取物的質(zhì)量，制備出訶子標(biāo)準(zhǔn)提取物奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津）；DiamonsilTMC18柱（4.6 mm ×250 mm，5μ m）；工作站：CBM-102（日本島津）；檢測(cè)器：SPD-20A（日本島津）；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（版本2004A）（中國藥典委員會(huì)推薦）。

1.2 試劑 訶子酸對(duì)照品由劉延澤教授提供，經(jīng)光譜鑒定、HPLC檢測(cè)純度在95%以上；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。柱層析用吸附劑Toyopearl HW-40（C）為日本Tosoh公司產(chǎn)品。

1.3 藥材 訶子，產(chǎn)地云南，由陳隨清教授鑒定為使君子科植物訶子Terninalia chebulaRetz.。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsilTMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相采用線性梯度洗脫，A相為甲醇，B相為0.5%的冰醋酸水溶液，體積流量1.0 mL/min，SPD-20A 檢測(cè)器，柱溫30 ℃，波長254 nm，分析時(shí)間60 min。線性梯度洗脫程序見表1。

表1 線性梯度洗脫程序

2.2 提取因素水平的確定 用浸漬法進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)因素水平見表2。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 采用正交實(shí)驗(yàn)表L8（27）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。

2.4 提取液的制備［5］稱取訶子粗粉8份，每份10 g，精密稱定，分別按照2.3項(xiàng)條件提取，過濾，合并提取液，定容至500 mL，備用。精密量取各正交實(shí)驗(yàn)條件下提取液10 mL，揮干溶劑，以70%丙酮定容于100 mL量瓶中，于60℃減壓濃縮至5 mL，上ToyopearlHW-40（C）柱（1 cm，柱長20 cm，吸附劑高10 cm）進(jìn)行柱層析，依次用蒸餾水50 mL、5%甲醇50 mL洗脫除去雜質(zhì)，然后用甲醇-丙酮-水（6∶2∶2）300 mL洗脫（至洗脫液三氯化鐵-鐵氰化鉀薄層顯色反應(yīng)為陰性），所得洗脫液于60℃減壓濃縮至干，用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析，選定的色譜峰面積結(jié)果見表3。

表2 因素水平

另稱取訶子粗粉10 g，用70%丙酮提取3次，每次150 mL，過濾，合并提取液，定容至500 mL。余操作同上，取續(xù)濾液進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析，以選定色譜峰面積作為單寧類成分近似完全浸出的基準(zhǔn)。

表3 指標(biāo)峰峰面積值

2.5 對(duì)照品溶液的制備與測(cè)定 精密稱取訶子酸對(duì)照品1.19 mg，置1 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，制成對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，作為對(duì)照。

2.6 訶子提取工藝與HPLC圖譜的相關(guān)性 通過指紋圖譜分析軟件，把訶子各提取工藝條件下的色譜圖重疊比較；然后求得各提取工藝與70%丙酮提取結(jié)果的相似度K。結(jié)果見表4、表7、表8。

2.7 結(jié)果分析 選定正交表各個(gè)實(shí)驗(yàn)指紋圖譜當(dāng)中13個(gè)共有色譜峰的峰面積作為提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化綜合處理［6］。以Xij表示正交實(shí)驗(yàn)的第i次實(shí)驗(yàn)的色譜圖中第j個(gè)色譜峰峰面積值，以各指標(biāo)的最大值（Xj）max（即各色譜圖中同一相對(duì)保留時(shí)間的各色譜峰中峰面積值最大者）作為參照，對(duì)同一指標(biāo)各數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，Dij表示第j個(gè)指標(biāo)下的第i個(gè)測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。

再按各指標(biāo)的重要程度和各組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差確定加權(quán)系數(shù)。以SDj表示第j個(gè)指標(biāo)下Dij的標(biāo)準(zhǔn)差，以RSDj表示第j個(gè)指標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，然后再根據(jù)各指標(biāo)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差賦權(quán)RSD/RSDj，其中RSD為指定指標(biāo)（參照物訶子酸）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差；根據(jù)各指標(biāo)的重要程度賦權(quán)為Ej，由于要全面考慮到訶子中的各個(gè)組分，故認(rèn)為指紋圖譜中的各個(gè)色譜峰（群）所代表的各組分（群）都很重要，均設(shè)為1即Ej=1。結(jié)合各指標(biāo)的重要程度和各組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差確定的權(quán)重系數(shù)為：

因此，多指標(biāo)實(shí)驗(yàn)公式為：

設(shè)P9為1，則其余各實(shí)驗(yàn)丹寧提取率為

［4］式計(jì)算所得為兼顧各指標(biāo)綜合效應(yīng)結(jié)果，得分越大越好。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析和方差分析。結(jié)果見表4～8。

以提取率為指標(biāo)時(shí)，訶子的粒度、乙醇濃度、提取時(shí)間、乙醇濃度與提取次數(shù)的相互作用對(duì)訶子指紋圖譜所指定的13個(gè)色譜峰峰面積變化有顯著影響。各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響次序?yàn)锽＞D＞A＞E＞C。由于B、E的交互作用顯著，根據(jù)表4得B2E2為最優(yōu)搭配。以相似度為指標(biāo)時(shí)，溶劑量對(duì)各實(shí)驗(yàn)條件下所提成分與丙酮提取物的相似性有顯著影響。綜合上述分析結(jié)果，確定優(yōu)化的提取工藝條件為A2B2C1D2E2，即訶子粉碎粒度60目、乙醇濃度70%、8倍溶劑量、攪拌提取3次、每次30 min。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

表5 提取率交互作用

表6 提取率方差分析

表7 相似度交互作用

表8 相似度方差分析

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)選出的最佳工藝條件，用同一批藥材重復(fù)提取3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照2.7項(xiàng)下方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見表9。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)

表明此提取工藝合理可行、穩(wěn)定。

3 討論

3.1 訶子中的有效成分丹寧為多羥基化合物，該類成分在光照和高溫條件下不穩(wěn)定，極易發(fā)生結(jié)構(gòu)降解。成分穩(wěn)定性差的特點(diǎn)限制了它的制劑開發(fā)。在對(duì)訶子中的丹寧成分進(jìn)行提取時(shí)，應(yīng)控制好提取的溫度和時(shí)間，力求快速、完全，以達(dá)到不破壞丹寧類成分之目的。所以我們選用多重冷浸并攪拌提取的方法，通過正交實(shí)驗(yàn)考察粒度、乙醇濃度、溶劑量、攪拌時(shí)間、提取次數(shù)等因素，最終確定最優(yōu)提取條件為：將訶子粉碎成60目粗粉，8倍量70%乙醇提取3次，每次30 min。

3.2 對(duì)于丹寧類成分，目前公認(rèn)70%丙酮是提取率高、使結(jié)構(gòu)保持較好穩(wěn)定性的提取溶劑，故本實(shí)驗(yàn)將其提取物的指紋圖譜總峰面積作為比較丹寧類成分提取率的基準(zhǔn)，以及提取條件對(duì)丹寧成分結(jié)構(gòu)變化（相似度）的比較基準(zhǔn)。但是由于丙酮的毒性和價(jià)格原因，不宜作為訶子總丹寧工業(yè)化提取的溶劑［5，7-8］，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙醇為提取溶劑，結(jié)果表明提取效果與丙酮相接近。

3.3 對(duì)于成分復(fù)雜的中藥制劑，在其制劑工藝研究中，僅僅考察單一指標(biāo)性成分或總成分的提取率，往往不能夠全面反映制劑工藝因素對(duì)總體有效成分的含量與穩(wěn)定性的影響，因而也就不能真正找到合理的制劑工藝條件，無法做到制劑質(zhì)量的穩(wěn)定可控。指紋圖譜技術(shù)是目前認(rèn)為比較能反映中藥制劑綜合成分狀態(tài)的質(zhì)量控制方法，其用于中藥制劑工藝還處于探索階段。本研究用訶子提取工藝的HPLC指紋圖譜特征色譜峰的面積變化量，以及與70%丙酮提取物的色譜峰相似度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，基本能夠體現(xiàn)工藝條件對(duì)訶子中有效成分的提取效果的全面影響，準(zhǔn)確說明該工藝的優(yōu)劣，最大限度地保留訶子中的有效成分，從而更加全面的體現(xiàn)訶子自身的藥理活性，保證成品的質(zhì)量。

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R944.2+7

A

1001-1528（2011）07-1168-04

2010-08-31

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（524410076）

劉雅敏（1960—），教授，研究方向：中藥固體制劑技術(shù)。Tel：（0371）65575822，E-mail：lymll2001@yahoo.com.cn