靈仙新苷微乳的制備及其初步藥效學(xué)研究

董彩霞， 李默影， 姚 嵐， 李豐文， 李運(yùn)曼， 劉麗芳*

（1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥分析教研室，江蘇南京211198；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇南京 210009）

靈仙新苷微乳的制備及其初步藥效學(xué)研究

董彩霞1， 李默影1， 姚 嵐1， 李豐文1， 李運(yùn)曼2， 劉麗芳1*

（1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥分析教研室，江蘇南京211198；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇南京 210009）

目的 制備均一穩(wěn)定的靈仙新苷（clematichinenoside，AR）油包水微乳，并初步考察其對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的治療作用，為威靈仙中藥單體藥物制劑的開(kāi)發(fā)提供藥效學(xué)基礎(chǔ)。方法 選用卵磷脂和乙醇分別作為表面活性劑和助表面活性劑，油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944Cs）作為油相，AR水溶液為水相，繪制偽三元相圖以確定各成分質(zhì)量比。通過(guò)在小鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（CFA）制備佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型。以體質(zhì)量、腫脹率、胸腺與脾臟指數(shù)為主要檢測(cè)指標(biāo)，并觀察小鼠病變部位的組織形態(tài)來(lái)比較AR微乳與AR溶液及陽(yáng)性對(duì)照藥白芍總苷的差異。結(jié)果 確定Km=1∶1，處方組成為油相50%，混合表面活性劑35%，水相15%，得到AR微乳為澄清的淡黃色溶液，平均粒徑為10.7 nm。AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠療效略好于AR溶液，且AR微乳能更好地改善佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的病理形態(tài)及病變部位的組織形態(tài)。結(jié)論 AR皂苷微乳粒徑較小，脂溶性強(qiáng)，能夠增加藥物在體內(nèi)的生物利用度。這表明微乳作為新的藥物劑型具有廣泛的應(yīng)用前景。另一方面由于制劑促進(jìn)藥物吸收的機(jī)制并不是單一的，仍需進(jìn)一步研究。

靈仙新苷；油包水微乳；藥效學(xué)

中藥威靈仙來(lái)源于毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團(tuán)鐵線蓮Clematis hexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr.的干燥根及根莖。具祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痛等功效［1］。靈仙新苷（clematichinenoside，AR）是威靈仙的皂苷提取物，具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用［2］。但因其相對(duì)分子質(zhì)量較大［3］，水溶性較好，不易通過(guò)細(xì)胞膜，從而影響其在生物體內(nèi)的吸收利用。

微乳（microemulsion，ME）是由油相、水相、表面活性劑及助表面活性劑四元體系自發(fā)形成的系統(tǒng)，具有外觀透明、各向同性、黏度低及熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)。油包水型（W/O）微乳作為口服藥物載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：可延長(zhǎng)水溶性藥物的釋放時(shí)間而起到緩釋作用；促進(jìn)藥物的吸收，避免首關(guān)效應(yīng)，可提高藥物的生物利用度［4］。

本研究采用偽三元相圖法將AR制成油包水（W/O）微乳，并初步考察了AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的治療作用，為AR乳劑的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

AUY120型電子分析天平（日本shimadzu公司），微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器公司），WZS-1型阿貝折光儀（上海儀器廠），DV-II+Pro Brookfield粘度計(jì)（美國(guó)博力飛），粒徑分析儀（美國(guó)Beckman Coulter N4 plus），Agilent1200液相色譜儀，Diamonsil C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm，美國(guó)迪馬公司），足跖容積測(cè)量器皿（中國(guó)藥科大學(xué)自制）。

1.2 藥物與試劑

靈仙新苷（AR），由本實(shí)驗(yàn)室提取純化，純度大于90%；卵磷脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944Cs，法國(guó)佳法賽公司）白芍總苷膠囊（TGP，寧波立華制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：061201），規(guī)格：0.3 g/粒（含芍藥總苷不少于104 mg）；弗氏完全佐劑（Freund＇s complete adjuvant，sigma公司，批號(hào)：058K8702），乙醇為分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雄性，共48只，由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2007-0001。

2 方法

2.1 微乳偽三元相圖的繪制

精密稱取卵磷脂和乙醇按一定比例混合均勻（表面活性劑/助表面活性劑=Km），即為混合表面活性劑，再與油相（油酸聚乙二醇甘油酯，Labrafil M 1944Cs）按不同比例（1 ∶9，2 ∶8，3 ∶7，4 ∶6，5 ∶5，6∶4，7∶3，8 ∶2，9 ∶1）渦旋混合均勻，向混合液中緩慢滴加蒸餾水并不斷振搖使體系充分混勻，當(dāng)體系由澄清透明變渾濁時(shí)為臨界點(diǎn)，記錄臨界點(diǎn)時(shí)加入的水量，按油，水，混合表面活性劑在臨界點(diǎn)的各自質(zhì)量百分?jǐn)?shù)（w/w）繪制偽三元相圖，確定微乳區(qū)。

考察不同的Km值對(duì)微乳形成區(qū)域的影響，在此基礎(chǔ)上固定Km值，考察不同的AR水溶液對(duì)微乳形成難易的影響。

2.2 AR微乳的制備

取Labrafil M 1944Cs與AR水溶液充分混合，再滴加處方量的混合表面活性劑，渦旋混合均勻，即得到靈仙新苷（AR）油包水微乳。

2.3 微乳測(cè)定

定量吸取所制AR微乳，加入甲醇搖勻破乳后定容，參照文獻(xiàn)［3］，按外標(biāo)兩點(diǎn)法定量分析單位體積微乳中AR的量。

2.4 微乳理化性質(zhì)測(cè)定

黏度測(cè)定：取8～10 mL，加入黏度計(jì)圓筒中，連接轉(zhuǎn)子開(kāi)始測(cè)定。

折光率測(cè)定：按中國(guó)藥典2010版規(guī)定方法，恒溫20℃測(cè)定微乳的折光率。

粒徑測(cè)定：W/O微乳外相為非水介質(zhì)，因此將黏度和折光率作為粒度分析儀的設(shè)定參數(shù)后測(cè)定。

穩(wěn)定性：取微乳5 000 r/min離心30 min。

類型鑒別：用染色法［5］來(lái)鑒定，即根據(jù)紅色的油溶性染料蘇丹紅和藍(lán)色的水溶性染料亞甲基蘭在微乳中的擴(kuò)散快慢來(lái)進(jìn)行判定微乳類型。

2.5 AR微乳初步藥效學(xué)研究

取清潔級(jí)小鼠48只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為：模型組，AR微乳高劑量組（32 mg/kg），AR微乳中劑量組（16 mg/kg），AR微乳低劑量組（8 mg/kg），白芍總苷組（360 mg/kg），AR水溶液組（32 mg/kg）。于致炎前分別測(cè)量每只小鼠體質(zhì)量與足爪容積。測(cè)小鼠的足爪容積時(shí)用足跖容積測(cè)量器皿。右后足跖底部皮內(nèi)注射0.1 mL完全弗氏佐劑致炎［6］。致炎18 h后，各組采用灌胃的方法給予相應(yīng)劑量的藥物7 d，給藥體積為0.2 mL/10 g，每天一次。

給藥前，給藥第1天，第4天和第7天分別測(cè)量各組小鼠的體質(zhì)量，每天用玻璃容積法測(cè)小鼠致炎的右后足足跖容積，計(jì)算其腫脹率（%）。最后一次給藥24 h后將小鼠處死，切下右足做病理切片，剝離胸腺與脾臟，電子天平稱定質(zhì)量，以平均每100 g體質(zhì)量的臟器質(zhì)量作為指標(biāo)表示臟器指數(shù)［7］。

腫脹率=（致炎后足跖容積—致炎前足跖容積）/致炎前足跖容積×100%

3 結(jié)果

3.1 Km值及AR水溶液濃度對(duì)微乳形成的影響

選用Km 分別為1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、1.5 ∶1、2 ∶1，AR水溶液質(zhì)量濃度為150 mg/mL。相圖中左上側(cè)為微乳區(qū)（標(biāo)記為ME）。如圖1。

固定Km=1，選用空白水溶液與AR水溶液濃度分別為150 mg/mL、300 mg/mL、450 mg/mL繪制偽三元相圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 Km值對(duì)微乳形成區(qū)域的影響Fig.1 Effect of Km to the microemulsion region

圖2 AR濃度對(duì)微乳形成區(qū)域的影響Fig.2 Effect of the concentration of AR to the microemulsion region

由圖1可見(jiàn)，在含藥微乳中，隨Km值由1/3到1/1，微乳形成區(qū)域逐漸增大，之后隨著Km值的增加，微乳形成區(qū)域面積有減小的趨勢(shì)，故確定Km=1；由圖2可以看出，當(dāng)Km=1時(shí)，含藥微乳相圖中的微乳形成區(qū)域隨AR水溶液濃度增加而增大，均大于空白微乳，這可能與AR作為皂苷類成分具有一定的表面活性有關(guān)。當(dāng)處方組成為：油相50%，混合表面活性劑35%，水相15%時(shí)，可形成外觀均一，淡黃色澄清透明溶液。外標(biāo)兩點(diǎn)法測(cè)得高、中、低AR微乳的質(zhì)量濃度分別為：2.08、1.09、0.55 mg/mL。

3.2 微乳理化性質(zhì)

空白微乳與載藥微乳的黏度分別為76 cp和76.2 cp；折光率為 1.439 0 和 1.434 8；平均粒徑為10.7 nm和6.9 nm，經(jīng)離心后各體系仍澄清透明，無(wú)分層現(xiàn)象。染色結(jié)果顯示，蘇丹紅在微乳中的擴(kuò)散速度明顯快于亞甲基蘭，可以判定為W/O型微乳。

3.3 AR微乳藥效學(xué)研究結(jié)果

3.3.1 AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠體質(zhì)量的影響 在給藥過(guò)程中，5組小鼠的體質(zhì)量呈上升的趨勢(shì)，且AR微乳高，中，低劑量組，AR溶液組，白芍總苷組小鼠體質(zhì)量與模型組相比均沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明AR微乳、AR溶液、白芍總苷對(duì)發(fā)病小鼠的體質(zhì)量無(wú)影響。

圖3 AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠體質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of AR microemulsion on weight of primary AA mice

3.3.2 AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠足跖腫脹率的影響 在注射弗氏完全佐劑后，小鼠足跖腫脹率較注射前顯著升高，表明AA小鼠原發(fā)病變模型建立成功。RA病理表現(xiàn)復(fù)雜多樣，以關(guān)節(jié)的炎性腫脹、變形、滑膜增生、骨及軟骨破壞為主［8］。因此，測(cè)量足跖腫脹度是本實(shí)驗(yàn)中判斷AR藥效學(xué)的重要依據(jù)。模型組在這7 d內(nèi)足跖腫脹率呈上升的趨勢(shì)，給藥7 d內(nèi)，這5種藥物對(duì)小鼠足跖腫脹率無(wú)顯著性差異，但是AR微乳高，中，低劑量及AR水溶液均能降低小鼠足跖腫脹率。

圖4 AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠足跖腫脹率的影響Fig.4 Effect of AR microemulsion on swollen ratio of primary AA mice與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

3.3.3 AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠原發(fā)病變臟器指數(shù)的影響 AR微乳組、溶液組、白芍總苷組均不會(huì)引起小鼠胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)的變化，說(shuō)明AR溶液與微乳均不會(huì)引起胸腺和脾臟的萎縮。

圖5 AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠原發(fā)病變臟器指數(shù)的影響Fig.5 Effect of AR microemulsion on organ index of primary AA mice

3.3.4 AR微乳對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠組織形態(tài)學(xué)的影響 從病理學(xué)測(cè)定結(jié)果也表明，5種藥物組小鼠病變部位的組織形態(tài)好于模型組，說(shuō)明這5種藥物對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠的關(guān)節(jié)有保護(hù)作用。AR微乳給藥高劑量組形態(tài)與白芍總苷組較接近，改善佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變的程度為最好。而AR溶液組仍可見(jiàn)較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明在同等濃度下，AR微乳的效果較好。

圖6 病理切片圖Fig.6 Pathological picture15

4 討論

卵磷脂具有良好的生物相容性和乳化能力，以卵磷脂/乙醇作為混合表面活性劑可與多種油相形成穩(wěn)定的油包水微乳［9-11］，靈仙新苷（AR）作為皂苷類成分，具有一定的表面活性，其加入后提高了W/O微乳的形成區(qū)域，可以形成更高載藥量的微乳。在偽三元相圖中，Km=1∶1時(shí)微乳區(qū)域最大，可能由于Km＞1∶1時(shí)隨著系統(tǒng)中卵磷脂量升高液晶區(qū)減小從而使微乳面積減小所致［12］。

AR由于其相對(duì)分子質(zhì)量較大，水溶性較好，藥物分子不易透過(guò)生物膜從而影響其生物利用度。油包水微乳可使藥物脂溶性增強(qiáng)，粒徑小，能夠通過(guò)胃腸壁水化層直接與胃腸上皮細(xì)胞接觸，促進(jìn)藥物吸收；此外口服后能夠經(jīng)淋巴吸收從而克服了肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高生物利用度。

本實(shí)驗(yàn)中采用白芍總苷（TGP）作為陽(yáng)性對(duì)照藥，對(duì)多種炎癥性病理模型如大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型等具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，其在多個(gè)環(huán)節(jié)影響細(xì)胞免疫、體液免疫及炎癥過(guò)程，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛及保肝和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用，為多種免疫性疾病的治療提供了良好選擇［13］。本研究表明AR微乳相比AR溶液對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變小鼠可更好地改善其病理形態(tài)。但制劑促進(jìn)藥物吸收的機(jī)制并不是單一的，仍需進(jìn)一步研究。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：234.

［2］呂 雪，方偉蓉，李云曼，等.靈仙新苷鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)新藥雜志，2009，18（16）：1535-1539.

［3］Ma Xiaoli，Xie Le，Liu Lifang，et al.Simultaneous Quantification of Seven Main Triterpenoid Saponins in Radix et Rhizoma Clematidis by LC-ELSD［J］.Chromatographia，2009，69（3）：437-442.

［4］楊 蕊，蘇樂(lè)群，黃 欣.微乳在藥劑學(xué)中的研究進(jìn)展及應(yīng)用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（8）：1141-1144.

［5］陸 彬，張正全.用三角相圖法研究藥用微乳的形成條件［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36（1）：58-62.

［6］Gauldie S D，McQueen D S，Clarke C J.et al.A robust model of adjuvant-induced chronic unilateRAl arthritis in two mouse strains［J］.J Neurosci Methods，2004，139：281-291.

［7］鄭召嶺，商 瑋，趙智明，等.甲氨蝶呤對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫器官重量的影響［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29（1）：29-30.

［8］Chillingworth N L，Donaldson L F.Characterisation of a Freund＇s complete adjuvant-induced model of chronic arthritis in mice［J］.J Neurosci Methods，2003，128：45-52.

［9］魯 瑩，蔣雪濤，曾仁杰.卵磷脂微乳的制備與理化性質(zhì)考察［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（1）：52 ～55.

［10］柳大烈，潘 葵，王渭濱.鹽酸罌粟堿2卵磷脂微乳的制備與透皮吸收［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，26（12）：1482-1485.

［11］韓 旻，傅 韶，方曉玲.三七總皂苷油包水微乳的處方篩選及體內(nèi)外評(píng)價(jià)［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（7）：780-786.

［12］Corswant C V，Engstrom S，Soderman O.Microemulsions based on soybean phosphatidylcholine and triglycerids.Phase behavior and microstructure［J］.Langmuir，1997，13：061-5070.

［13］張?jiān)闯保瑢O紅勝，潘正論，等.白芍總苷在風(fēng)濕免疫病中的研究進(jìn)展［J］.世界臨床藥物，2010，31（8）：449-453.

The preparation and preliminary pharmacodynamics of clematichinenoside microemulsion

DONG Cai-xia1， LI Mo-ying1， YAO Lan1， LI Feng-wen1， LI Yun-man2， LIU Li-fang1

（1.Analysis Department of Chinese Medicine，China Pharmeceutical University，Nanjing 211198，China；2.Department of Pharmacology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

AIMTo prepare homogeneous and stable water in oil（W/O）microemulsion，and evaluate its therapeutic effect to primary adjuvant arthritis mice，provide background of pharmacodynamics for clematichinenoside AR.METHODSTo use lecithin and ethanol as surfactant and cosurfactant，Labrafil M 1944Cs as the oil phase and AR solution as aqueous phase，determine the mass ratio of the components by pseudo-ternary phase diagram.Adjuvant arthritis（AA）model was established through intradermal injection of Freund＇s complete adjuvant（CFA）to right metaleg voix pedis of mice.To use the body weight，swelling rate，thymus and spleen index as the main detection index and to observe the morphology of the diseased region in mice to evaluate the difference among AR solution，AR microemulsion，and TGP which was used as the positive control drug.RESULTSThe formulation of AR microemulsion which was clear light yellow solution was as follows：Km=1 ∶1，50%oil，35%of mixed surfactants，aqueous 15%，with the mean particle size of 10.7 nm.The results showed AR microemulsion could improve the pathological lesion and the morphology in diseased region of primary AA mice.CONCLUSIONAR microemulsion，with smaller particle size and better liposolubility，is able to increase drug bioavailabilityin vivo，which shows that the microemulsion has broad application prospects as a new formulation of drugs.On the other hand，the mechanism of promoting drug absorption is not single and further study is still needed.

clematichinenoside；water in oil microemulsion；pharmacodynamics

book=7,ebook=343

R944.2+7

A

1001-1528（2011）07-1158-06

2010-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（30772770）

董彩霞（1985—），女，碩士生，從事中藥分析研究。

*通信作者：劉麗芳（1969—），女，博士，教授，主要從事中藥活性成分和動(dòng)物藥研究。Tel：（025）86185373，E-mail：liulifang69@126.com