補腎活血方治療骨質(zhì)疏松癥機制研究及探討

陳曉飛， 陳素紅， 呂圭源， 肖魯偉， 樓招歡

（1.溫州醫(yī)學院，浙江 溫州325035；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州 310053）

補腎活血方治療骨質(zhì)疏松癥機制研究及探討

陳曉飛1， 陳素紅1， 呂圭源2*， 肖魯偉2， 樓招歡2

（1.溫州醫(yī)學院，浙江 溫州325035；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州 310053）

目的 研究補腎活血方（熟地、杜仲、制附子、枸杞、肉桂、山茱萸、桃仁、紅花、山藥、甘草）對微循環(huán)障礙小鼠的活血作用及對正常小鼠動脈血電解質(zhì)、血氧量、酸堿平衡等指標的影響。方法 ①采用注射垂體后葉素造成尾部微循環(huán)障礙小鼠模型。各組小鼠連續(xù)給藥10 d，末次給藥1 h后，檢測小鼠尾部微循環(huán)血流值相對比值，尾靜脈注射垂體后葉素0.02 u，2 min后再次檢測，計算注射前后兩者之差；②采用戊巴比妥鈉麻醉后測定動脈血中電解質(zhì)、酸堿平衡及血氧量。各組小鼠連續(xù)給藥10 d，末次給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血0.6 mL，NOVA血氣-電解質(zhì)分析儀測定動脈血中電解質(zhì)、酸堿平衡及血氧量指標。結(jié)果 與正常對照組比較，補腎活血方（20 g/kg）能增加由注射垂體后葉素所致的小鼠尾部微循環(huán)血流比值；與正常對照組比較，補腎活血方（40 g/kg）能顯著性減少小鼠腹腔動脈血中的Na+、Ca2+濃度；顯著性降低小鼠腹腔動脈血酸堿平衡中的BE-ECF、SBC；顯著性增加小鼠腹腔動脈血中的PO2、a/A、PO2/FI值（P＜0.05～0.01）。結(jié)論 補腎活血方通過協(xié)調(diào)鈣離子吸收、提高血液載氧量、改善血液微循環(huán)以及調(diào)整酸性體質(zhì)等

補腎活血方；垂體后葉素；電解質(zhì)；酸堿平衡；血氣

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是以單位體積內(nèi)骨量減少和骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的一種全身性骨骼疾病，為骨科的常見病、多發(fā)?。?］。其臨床表現(xiàn)主要有骨折、疼痛及肌力低下等其他非特異性癥狀，多發(fā)于中老年患者。該病早期可無任何癥狀，隨著病情發(fā)展出現(xiàn)脊柱變形、脊柱椎體壓縮性骨折等［2］異常。隨著世界人口的不斷老齡化，骨質(zhì)疏松已成為全球性的衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的材料顯示，目前世界上骨質(zhì)疏松患者約達2億人，其發(fā)病率已躍居第四，僅次于癌癥、心血管病和糖尿病，嚴重影響了患者正常的工作和生活［3］。我國已將骨質(zhì)疏松列為3大重點攻關(guān)研究的老年疾病之一，因而研究開發(fā)防治骨質(zhì)疏松的藥物和方法具有重要的臨床價值和現(xiàn)實意義［4］。前期的藥效學實驗結(jié)果表明，補腎活血方能促進成骨細胞的增殖、分化，并能顯著提高成骨細胞的活性，對骨質(zhì)疏松癥狀有改善作用。本實驗擬在前期實驗基礎(chǔ)上進一步探討補腎活血方治療骨質(zhì)疏松癥機制，為補腎活血顆粒的研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠84只，清潔級，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半。均由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)生產(chǎn)合格證號為SCXK（浙）2003-0001號。

1.2 儀器設(shè)備

激光多普勒血流儀（浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供）；美國NOVA血氣-電解質(zhì)分析儀（美國Nova Biomedical公司）；深圳君斯達JS-509運動秒表（深圳市君斯達實業(yè)有限公司）；蘇制00000153電子天平（常熟市衡器廠）。

1.3 藥物試劑

補腎活血方由右歸飲加桃仁、紅花組成（具體工藝為：熟地、杜仲、附子等8味藥水提，肉桂、桃仁2味藥醇提。水提部分飲片浸泡1 h，加入12倍量水回流提取3次，每次1.5 h；提取液減壓濃縮至相對密度為1.05，再加入95%乙醇使含醇量為60%，醇沉24 h，回收乙醇；醇提部分飲片以10倍60%乙醇量浸泡1 h，提取3次，每次1.5 h；減壓回收乙醇；合并水提及醇提部分藥液，減壓濃縮至含生藥2 g/mL）。骨疏康顆粒，遼寧康辰藥業(yè)有限公司，批號：090505；垂體后葉注射液，南京新百藥業(yè)公司，批號：090901，用前用生理鹽水稀釋成0.2單位/mL的溶液；0.9%氯化鈉溶液，批號：國藥準字H33021543，浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司；戊巴比妥鈉，規(guī)格：25 g/瓶，國藥集團化學試劑有限公司進口分裝，批號：Lot.No.WS20060401；血氣-電解質(zhì)試劑包，美國 Nova Biomedical公司，批號：AEF 19667 LOT：612033。

1.4 實驗方法

1.4.1 對微循環(huán)障礙小鼠尾部血流相對比值的影響 取ICR小鼠60只，清潔級，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，按性別和體質(zhì)量隨機分為5組，模型組、骨疏康對照組（2.7 g/kg）、補腎活血方（5 g/kg）組、補腎活血方（10 g/kg）組、補腎活血方（20 g/kg）組，每組12只；各給藥組分別給予相應(yīng)的藥物，給藥量0.1 mL/10 g，模型組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)10 d。末次給藥1 h后，檢測小鼠尾部微循環(huán)血流指標（調(diào)節(jié)微循環(huán)血流儀，設(shè)置時間常數(shù)0.22 s，頻率響應(yīng)10 kHz，增益2），將小鼠置固定器內(nèi)，暴露其尾部，在尾部中1/3外交界處用激光探頭測定該部位微循環(huán)血流值相對比值，隨后尾靜脈注射垂體后葉素0.02單位，2 min后重復以上測定。相對比值差=注射前微循環(huán)血流值相對比值-注射后微循環(huán)血流值相對比值。

1.4.2 對動脈血中電解質(zhì)、酸堿平衡及血氧量的影響 ICR小鼠24只，清潔級，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，分為2組，每組12只，包括正常對照組、補腎活血方（40 g/kg）組；按相應(yīng)劑量，分別給予生理鹽水和相應(yīng)的藥液，給藥量為0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)10 d。于末次給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液將小鼠麻醉，用含肝素抗凝的1 mL注射器（注射器內(nèi)無氣泡）在腹主動脈內(nèi)抽取血0.6 mL，抽取后立即密封注射器針頭，以避免有空氣接觸，搖勻，立刻在NOVA血氣-電解質(zhì)分析儀上測定動脈血中血氣指標，包括血 Na+、K+、Cl-、Ca2+、二氧化碳分壓（PCO2）、二氧化碳總量（TCO2）、細胞外剩余堿（BE-ECF）、剩余堿（BE-B）、標準碳酸氫根濃度（SBC）、碳酸氫根濃度（HCO3-）、血紅蛋白濃度（Hb）、紅細胞壓積（Hct）、氧分壓（PO2）、血氧量（O2ct）、血pH值、血氧飽和度（SO2）、肺泡內(nèi)氧分壓與動脈血氧分壓之差（AaDO2）、肺泡內(nèi)氧分壓（A）、動脈血氧分壓與肺泡內(nèi)氧分壓之比（a/A）。

2 結(jié)果

2.1 對垂體后葉素致微循環(huán)障礙小鼠尾部血流相對比值的影響

由表1可見，垂體后葉素注射前，各組小鼠尾部微循環(huán)血流相對比值均無顯著性差異。與正常對照組比，骨疏康對照組（2.7 g/kg）、補腎活血方（20 g/kg）組小鼠尾部微循環(huán)血流相對比值的差值明顯降低（P＜0.05）。提示補腎活血方（20 g/kg）能改善注射垂體后葉素所致小鼠尾部微循環(huán)障礙。?

表1 補腎活血方對小鼠血流值相對比值的影響（±s，n=12）Tab.1 The impact of Bushen Huoxue Recipe on relative ratio of blood flow（±s，n=12）

表1 補腎活血方對小鼠血流值相對比值的影響（±s，n=12）Tab.1 The impact of Bushen Huoxue Recipe on relative ratio of blood flow（±s，n=12）

注：與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal group.

組別 劑量/（g/kg）相對血流比值垂體后葉素注射前垂體后葉素注射后垂體后葉素注射前后差正常對照組- 10.63±1.97 5.78±0.96 4.85±1.87骨疏康對照組 2.7 9.48±1.33 6.84±1.02 2.64±1.73*補腎活血方組 5 10.78±2.05 5.53±1.04 5.25±2.12 10 10.69±1.68 5.78±1.41 5.53±1.04 20 9.48±0.94 6.23±0.98 3.26±1.34*

2.2 對電解質(zhì)的影響

由表2可見，補腎活血方給藥組小鼠腹腔動脈血中的Na+、Ca2+濃度明顯低于正常組（P＜0.05，P＜0.01），而K+濃度有下降趨勢。提示補腎活血方使鈣離子可能吸收進入骨骼中沉淀，此時骨形成大于骨丟失，鈣離子吸收增加，促進骨骼強壯。

2.3 對酸堿平衡的影響

由表3可見，補腎活血方給藥組小鼠腹腔動脈血中BE-ECF、SBC均明顯低于正常組；而 pH值、HCO3-、TCO2均有下降趨勢，BE-B呈升高趨勢。

表2 正常組與給藥組電解質(zhì)的比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison of electrolyte between the normal group and the treatment group

表2 正常組與給藥組電解質(zhì)的比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison of electrolyte between the normal group and the treatment group

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group.

組別 劑量/（g/kg）鈉離子Na+/（mmol/L）鉀離子K+/（mmol/L）鈣離子Ca2+/（mmol/L）- 156.06±1.90 3.37±0.57 0.77±0.11補腎活血方組 40 147.02±8.99＊＊3.09±0.38 0.43±0.26正常對照組＊＊

2.4 對動脈血氧分壓和氧量的影響

由表4可見，補腎活血方給藥組小鼠腹腔動脈血PO2、PO2/FI顯著高于正常組（P＜0.05），a/A顯著高于正常組（P＜0.05，P＜0.01）。SO2、O2Ct、PCO2較正常組有升高趨勢；Hct、Hb、A均有降低趨勢。

3 討論

中醫(yī)理論認為“腎主骨生髓”，腎虛是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因。腎藏精，精生髓，髓藏于骨中，滋養(yǎng)骨骼［5］，因此骨的生長、發(fā)育、修復都有賴于腎之精氣的滋養(yǎng)和推動。隨著年齡增高，腎氣漸衰，筋骨懈惰，腎精虧虛，骨骼失養(yǎng)，則骨骼脆弱無力［6］。臨床可見腰背酸痛、骨痛、關(guān)節(jié)疼痛，晝輕夜重等骨質(zhì)疏松的臨床癥狀，故其病因病機可歸納為腎虛為本，瘀血阻滯為標，屬中醫(yī)“骨痹”、“骨痿”范疇［7］。補腎活血方由熟地、杜仲、制附子等組成。方中熟地益髓填精、杜仲補肝腎、壯筋骨，為君藥；附子、肉桂補腎陽，山茱萸、枸杞養(yǎng)肝血，助主藥以滋腎養(yǎng)肝，是為臣藥；桃仁、紅花活血以散瘀止痛，為佐藥；諸藥合用，共奏補腎益精、活血化瘀、散寒止痛之功效。

表3 正常組與給藥組酸堿平衡的比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of acid-base balance in normal group and treatment group

表3 正常組與給藥組酸堿平衡的比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of acid-base balance in normal group and treatment group

注：與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal group.

組別 劑量/（g/kg） pH值 細胞外剩余堿BE-ECF/（mmol/L）剩余堿BE-B/（mmol/L）標準碳酸氫根濃度SBC/（mmol/L）碳酸氫根濃度HCO-3/（mmol/L）二氧化碳總量TCO2/（mmol/L）85 21.39±4.59 22.67±4.82補腎活血方組 40 7.34±0.036 -1.58±4.30* -0.76±3.76 23.83±3.16*正常對照組 - 7.32±0.069 -4.93±4.91 -2.55±5.42 21.12±3.24.38±4.29 25.77±4.54

表4 正常組與高劑量組腹腔動脈血氧分壓、氧含量的比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison of arterial blood gas in the normal group and the treatment group（x ± s，n=12）（1 mmHg=133.3 Pa）

表4 正常組與高劑量組腹腔動脈血氧分壓、氧含量的比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison of arterial blood gas in the normal group and the treatment group（x ± s，n=12）（1 mmHg=133.3 Pa）

注：與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group.

106.26補腎活血方組 40 5.98±1.18/FI正常對照組 - 5.54±1.33組別 劑量/（g/kg）PCO2/（mmHg）PO2/（mmHg）SO2/% Hct/% Hb/（g/dl）10.82±4.47 86.82±17.54 O2ct/（mL/dl）/（mmHg） a/A PO2 A 30.33±6.21 13.89±1.47*95.74±1.02 10.24±2.22 12.22±2.28 13.36±1.59 0.78±0.27 388.3±27.08±23.5 9.05±0.80 12.33±1.02 12.83±1.41 1.09±0.11＊＊498.33±52.64*

骨質(zhì)疏松是一種多病因所致的骨代謝性疾病，其發(fā)病機制較為復雜。現(xiàn)代醫(yī)學將鈣離子的流失［8］以及酸性體質(zhì)［9］列為導致骨質(zhì)疏松的重要原因。電解質(zhì)測試結(jié)果顯示，補腎活血方能使小鼠動脈血中的鈣離子濃度明顯減低，提示鈣離子可能吸收進入骨骼中沉淀，此時骨形成大于骨丟失，鈣離子吸收增加，促進骨骼強壯。同時補腎活血方能使血中氧分壓、氧分壓與吸氧濃度之比、動脈血氧分壓與肺泡內(nèi)氧分壓之比顯著性升高，提高血中載氧量，產(chǎn)生充足氣血，使骨細胞代謝旺盛。標準碳酸氫根濃度（SBC）為血液堿儲備，受腎調(diào)節(jié)，被認為是能準確反映代謝性酸堿平衡的指標。標準碳酸氫根濃度的升高提示補腎活血方可以改善酸性體質(zhì)，保持人體弱堿性環(huán)境，起到防止鈣流失的作用［10］。并且補腎活血方能改善微循環(huán)作用，使血液充盈，保持骨頭周圍的血管通暢，血液代謝正常，增加骨營養(yǎng)吸收，從而達到有效防治骨質(zhì)疏松的作用［11］。故補腎活血方可通過增加鈣離子吸收、提高血中載氧量、改善酸性體質(zhì)以及血液微循環(huán)多方面的相互協(xié)調(diào)作用，起到了有效預防和治療骨質(zhì)疏松的目的。

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Research and discussion on mechanism of treating osteoporosis by Bushen Huoxue Recipe

CHEN Xiao-fei1， CHEN Su-hong1， Lü Gui-yuan2， XIAO Lu-wei2， LOU Zhao-huan2
（1.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China；2.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China）

AIMTo explore the impacts of Bushen Huoxue Recipe（Rehmannia glutinosaLibosch，Carthamus tinctoriusL.，Aconitum carmichaeliDebx，Dioscorea batatas，Cornus OfficinalisSieb.Et Zucc.，Cinnamomum cassiaPresl，Lycium BarbarumL.，Eucommia ulmoidesOliv.，Prunus persica（L.）Batsch，Glycyrrhiza uralensisFisch）on both promoting blood flow effect in the tail microcirculation disturbance mice and arterial electrolyte，acid-base balance，blood oxygen content in normal mice.METHODSTail microcirculation disturbance mice model was set up by pituitrin injection，mice were under successive administration for 10 d，and the relative ratios of tail microcirculation blood flow were detected 1 h after the final administration，the detections were repeated，2 min after pituitrin（0.02 unit）was intravenous injected，then the both qualitative difference was calculated.After anesthetized by pentobarbital，electrolyte，acid-base balance and blood oxygen contents were detected，mice were under the same administration as above，they were anesthetized by pentobarbital 1 h after the final administration，then blood samples（volume=0.6 mL）taken from abdominal aorta were immediately inspected by NOVA blood oxygen-automatic electrolytes analyzer.RESULTSCompared with the normal group，Bushen Huoxue Recipe（20 g/kg）could dramatically increase the blood flow ratio in tail microcirculation disturbance mice interfered by pituitrin.While compared with the normal group，Bushen Huoxue Recipe（40 g/kg）could obviously decrease the Na+、Ca2+concentrations in celiac artery，and conspicuously increase the values of PO2、a/A and PO2/FI（P＜0.05～0.01）.CONCLUSIONBushen Huoxue Recipe could perform the function of preventing and curing osteoporosis，mainly involved promoting calcium absorption，improving blood oxygen-carrying capacity，facilitating blood microcirculation and ameliorating acidic constitution.

Bushen Huoxue Recipe；hypophysin；electrolyte；acid-base balance；blood gas indexes

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1130-05

2011-02-19

浙江省中醫(yī)藥科技計劃重大項目（2006Z003）；浙江省中醫(yī)藥現(xiàn)代化專項資金（浙經(jīng)信醫(yī)化［2010］421號）

陳曉飛（1985—），男，碩士，研究方向：中藥藥理學。E-mail：vencher_9@163.com

*通信作者：呂圭源（1954—），男，博士生導師，教授。Tel：（0571）86613601，E-mail：lv.gy@263.com多方面因素，發(fā)揮預防和治療骨質(zhì)疏松作用。