RP-HPLC測定大鼠口服葛根后血漿中大豆苷元的含量

張 梅， 劉 靜， 劉 軍， 謝學(xué)軍

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都 610075)

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。葛根中所含主要活性成分為異黃酮類化合物，大豆苷元是其所含的異黃酮類成分之一，具有抗心律不齊、抗氧化、加速骨細(xì)胞生成、降低糖尿病大鼠血小板聚集率等廣泛生理活性［1-2］。作者的前期研究表明，由葛根、丹參等組成的復(fù)方制劑對糖尿病性視網(wǎng)膜病變及視神經(jīng)病變具有較好的防治作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了深入的研究［3-5］。研究結(jié)果也顯示大豆苷元是葛根及復(fù)方給藥后血漿中的血藥濃度較高的原型活性成分。為進(jìn)一步探討葛根及復(fù)方防治糖尿病性眼病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，了解入血成分的代謝情況，闡明復(fù)方制劑的配伍機(jī)制，作者采用中藥血清藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對葛根給藥血漿中大豆苷元的含量測定方法進(jìn)行了研究，為后續(xù)含葛根復(fù)方制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器及材料

1.1 儀器

島津10AP系列高效液相色譜儀，包括SIL-HTc進(jìn)樣器，CTO-10ASVP柱溫箱，LC-10ADVP高壓泵，SPD-10AVP紫外檢測器;德國Eppendorf5810R型低溫離心機(jī);Phenomenex Luna C18高效液相色譜柱(4.60 mm ×250 mm，5μm)，Phenomenex C18高效液相保護(hù)柱(4 mm×3.0 mm)。

1.2 藥品及試劑

葛根購于成都荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。大豆苷元(daidzein)對照品，購于成都曼思特生物科技，批號:446-72-0，純度≥98%。精密稱取大豆苷元對照品適量，甲醇溶解后得到濃度為100 μg/mL的對照品貯備液，－20℃密封保存?zhèn)溆谩＜状?，色譜純，美國天地TEDIA試劑公司;甲酸，色譜純，美國天地TEDIA試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD大鼠，體重(180±20)g，♀♂不限，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，合格證號:SCXK(川)2006-18。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Luna C18高效液相色譜柱(4.60 mm ×250 mm，5 μm)，Phenomenex C18高效液相保護(hù)柱(4 mm×3.0 mm);流動相:甲醇－0.1%甲酸水溶液(60∶40，v/v)，抽濾后超聲波脫氣使用;流速1 mL/min，柱溫25℃;檢測波長260 nm，進(jìn)樣量 20 μL。

2.2 血漿樣品的制備

取待測血漿0.2 mL加入4倍量(0.8 mL)甲醇，漩渦混勻后于低溫離心機(jī)離心(10 000 r/min，10 min)。取上清液于尖底試管，置50℃水浴中并通空氣流揮干，殘渣加0.2 mL甲醇溶解，漩渦混勻后于低溫離心機(jī)離心(2 500 r/min，3 min)，取上清液20 μl，注入高效液相色譜儀，測定。

2.3 專屬性及檢測限

分別吸取空白血漿、空白血漿加大豆苷元、葛根給藥血漿、按2.2項(xiàng)下操作，進(jìn)樣，行HPLC分析，色譜圖如圖1。在此色譜條件下，大豆苷元保留時間為5.7 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)基本不干擾樣品的分離測定。血漿中大豆苷元的最低定量濃度為 0.1 μg/mL。

圖1 血漿樣品HPLC圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取大豆苷元對照品貯備液適量，甲醇稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與0.2 mL空白血漿混合，得到梯度為 0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL的大豆苷元血漿樣品，按2.2項(xiàng)下處理。以大豆苷元的峰面積與大豆苷元的濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=74 069X－29 274，r=0.998 8。大豆苷元在0.1～64 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 方法精密度

取空白血漿，分別加入高、中、中低及低4種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)的大豆苷元對照品，制得各對照品血漿樣品，按2.2項(xiàng)下操作，進(jìn)樣，測定，根據(jù)大豆苷元的峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其濃度。在同一天內(nèi)每一濃度的樣品重復(fù)處理5份，進(jìn)樣測定，其RSD分別為1.6%、5.3%、4.8%、5.7%。于1周內(nèi)不同日重復(fù)測定，其RSD分別為1.8%、2.7% 、7.0% 、9.3% 。

2.6 穩(wěn)定性

2.6.1 萃取物室溫放置穩(wěn)定性

取高、中、中低及低 4種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)的大豆苷元對照品血漿樣品，按2.2項(xiàng)下操作，分別于0，8，16h進(jìn)樣測定，其RSD分別為4.0%、8.4%、9.4%、8.0%，表明萃取物室溫放置16 h穩(wěn)定性良好。

2.6.2 反復(fù)凍融穩(wěn)定性

?。?0℃保存反復(fù)凍融1，2，3次的高、中、中低及低 4 種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)對照品血漿樣品，按2.2項(xiàng)下操作，測定，其RSD分別為3.4%、6.2%、7.3%、4.6%，結(jié)果表明反復(fù)凍融對測定結(jié)果無明顯影響。

2.7 回收率

取高、中、中低及低 4種濃度(32.0、8.0、2.0、0.5 μg/mL)的大豆苷元對照品血漿樣品，按2.2項(xiàng)下操作，測定。另取甲醇配制的同濃度大豆苷元對照品溶液直接進(jìn)樣測定，根據(jù)兩者峰面積比值計算回收率，測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明本方法回收率良好。

表1 大豆苷元回收率試驗(yàn)(n=5)

2.8 血漿樣品中大豆苷元的含量測定

將33只大鼠隨機(jī)分為9組，每組3只，禁食(自由飲水)12 h后，其中8組灌胃葛根浸膏，劑量10 g/kg，給藥后分別于 5、15、30、60、90、120、180、240 min肝門靜脈取血，加肝素抗凝，得到葛根給藥血漿，－30℃保存?zhèn)溆?剩余1組作為空白對照血漿，－30℃保存?zhèn)溆?。取各血漿樣品0.2 mL，按2.2項(xiàng)下操作，進(jìn)樣測定，以隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各血漿供試品中大豆苷元含量(x ± s，μg/mL)

3 討論

3.1 中藥血清藥物化學(xué)已經(jīng)成為中藥有效成分研究及復(fù)方配伍機(jī)制研究的重要手段［6］。以大豆苷元為指標(biāo)研究葛根提取物在動物體內(nèi)的代謝目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報道甚少。作者采用中藥血清藥物化學(xué)方法建立了穩(wěn)定可靠的血漿中大豆苷元的含量測定方法。研究結(jié)果為探討大豆苷元的體內(nèi)代謝規(guī)律，闡明葛根及其復(fù)方制劑防治糖尿病性眼病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 血漿中大豆苷元含量測定相關(guān)文獻(xiàn)報道較少，且已有的報道多為測定動物口服大豆苷元單體［7］或幾個異黃酮單體［8］等相對比較單純樣品后血漿中大豆苷元含量，未見研究大鼠口服葛根浸膏后血漿中大豆苷元含量變化的報道。

3.3 血漿樣品的前處理方法，本實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇沉淀法、熱水浴法、高氯酸沉淀法及固相萃取法進(jìn)行試驗(yàn)，從對待測組分的影響、干擾情況及操作簡便等方面進(jìn)行考察，確定采用甲醇沉淀法處理血漿樣品。甲醇與血漿的比例亦對分析結(jié)果有一定影響，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)最終選擇4倍量甲醇沉淀血漿。此外，大鼠含藥血漿特別是復(fù)方給藥血漿中大豆苷元的含量較低，因此在測定過程中需要對血漿中的大豆苷元進(jìn)行富集。

3.4 大鼠口服葛根浸膏后，血漿中大豆苷元的濃度在20min內(nèi)達(dá)到峰值，這與已有文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［9-10］，但在60min以后其濃度又開始增加直到4h后降至低谷，原因可能是由于肝腸循環(huán)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］Rafii F，Davis C，Thomas M，et al.Variations in metabolism of the soy isoflavonoid daidzein by human intestinal microfloras from different individuals［J］.Arch Microbiol，2003，180:11-16.

［2］尹學(xué)哲，全吉淑，徐俊萍，等.大豆異黃酮苷元對糖尿病大鼠血小板聚集的抑制作用［J］.四川中醫(yī)，2007，25(1):12-13.

［3］謝學(xué)軍，李 翔，肖 丹，等.補(bǔ)腎活血中藥對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響［J］.中國中醫(yī)眼科雜志，2000，10(4):195.

［4］謝學(xué)軍，王 毅，秦 偉，等.補(bǔ)腎活血中藥對糖尿病大鼠視路NT-3和Nissl小體的影響［J］.中國中醫(yī)眼科雜志，2007，17(1):23.

［5］謝學(xué)軍，楊 紅，何 宇，等.補(bǔ)腎活血中藥對糖尿病大鼠視路膠質(zhì)纖維酸性蛋白和髓鞘堿性蛋白表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)眼科雜志，2007，17(5):265.

［6］王喜軍.中藥及中藥復(fù)方的血清藥物化學(xué)研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)一中藥現(xiàn)代化，2002，4(2):1-4.

［7］仇 峰，陳笑艷，鐘大放.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠血漿中大豆苷元及其葡萄糖苷酸結(jié)合物［J］.質(zhì)譜學(xué)報，2003，24(增刊):104.

［8］余 靜，趙人崢，吳 倩，等.同時測定大鼠血清中大豆異黃酮及其他代謝產(chǎn)物含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(5):961-963.

［9］Uehara M，Ohta A，Sskai K ，et al.Dietary Fructooligosaccharides modify intestinal bioavailability of a single dose of genistein and daidzein and affect their urinary excretion and kinetics in blood of rats［J］.ASN，2001，131:787-795.

［10］Bayer T，Thomas C，Dekant W.Disposition and biotransformation of the estrogenic isoflavone daidzein in rats［J］.Toxicolm Sci，2001，62:205-211.